發(fā)布時(shí)間：2018-01-08 06:17

  本文關(guān)鍵詞：蓖麻毒素和相思子毒素A鏈突變體疫苗候選抗原的研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:蓖麻毒素(ricin,RIC)和相思子毒素(abrin,ABR)是兩種植物來源的、毒性強(qiáng)的蛋白質(zhì)毒素,二者分子結(jié)構(gòu)相似,其全毒素均是由A、B兩條多肽鏈借助二硫鍵連接組成的異二聚體,相對(duì)分子質(zhì)量在62～67 kDa之間。RIC和ABR均屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白(RIP),它們的毒性作用機(jī)理相近,均是通過B鏈與細(xì)胞膜受體結(jié)合,幫助A鏈進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),從而發(fā)揮毒性作用。由于其毒性強(qiáng)、易于獲得和可氣溶膠化等特點(diǎn),RIC和ABR被認(rèn)為是重要的致死性生物毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖劑,其對(duì)社會(huì)公共安全的潛在威脅不容忽視。但是目前針對(duì)RIC和ABR生物防護(hù)的疫苗研究還較少,因此,發(fā)展有效的應(yīng)對(duì)RIC和ABR生物戰(zhàn)劑的醫(yī)學(xué)防護(hù)疫苗,具有十分重要的軍事和社會(huì)意義。 目的:本研究的目的就是構(gòu)建RIC A鏈突變體(mRICA)和ABR A鏈突變體(mABRA)以及RIC、ABR A鏈突變體的嵌合體蛋白(mRICA/mABRA),實(shí)現(xiàn)mRICA、mABRA突變體蛋白和mRICA/mABRA嵌合體蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的可溶性表達(dá)、快速純化及抗原性分析,將其作為免疫原免疫動(dòng)物,評(píng)價(jià)其對(duì)抗天然RIC和ABR中毒的免疫保護(hù)作用,篩選出有效的候選抗原,為制備RIC和ABR A鏈突變體疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法:通過定點(diǎn)突變的方法獲得ABR A鏈突變體基因(mABRAE164AR167L和mABRAE164AR167LN200P),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETHis-mABRA1和pETHis-mABRA2,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3),經(jīng)1.0 mM IPTG 30℃誘導(dǎo)表達(dá),篩選出最佳表達(dá)工程菌BL21(DE3)pLysS/pETHis-mABRA1和BL21(DE3)pLysS/pETHis-mABRA2。應(yīng)用前期已設(shè)計(jì)并合成的RIC A鏈突變體基因(mRICAD75AV76MY80A),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETHis-mRICA和pET28a-mRICA,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3),經(jīng)0.5 mM IPTG 16℃誘導(dǎo)表達(dá),篩選出最佳表達(dá)工程菌BL21(DE3)/pETHis-mRICA。采用柔性linker連接RIC A鏈突變體(mRICAD75AV76MY80A)和ABR A鏈突變體(mABRAE164AR167L)構(gòu)建嵌合體基因mRICA/mABRA,將mRICA/mABRA嵌合體基因亞克隆至原核表達(dá)載體pQE-80L、pQE-30、pTIG-Trx、pET-28a ,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE80L-mRICA/mABRA、pQE30-mRICA/mABRA、pTIGTrx-mRICA/mABRA和pET28a-mRICA/mABRA,再分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌M15或BL21(DE3),工程菌在18℃經(jīng)0.1 mM的IPTG誘導(dǎo)14 h ,篩選出最佳表達(dá)工程菌M15/pQE80L-mRICA/mABRA。表達(dá)的mRICA、mABRA1、mABRA2突變體蛋白以及mRICA/mABRA嵌合體蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化,通過ELISA和WB印跡檢測四種蛋白的抗原性。將純化后的蛋白作為免疫原,采用以下五種形式與鋁佐劑混合后分別免疫Balb/c小鼠:mRICA、mABRA1、mABRA2、mRICA和mABRA1混合物以及嵌合體蛋白mRICA/mABRA。每種免疫原分兩種免疫途徑:肌肉注射和皮下多點(diǎn)注射,免疫以后血清中抗體效價(jià)采用間接ELISA方法進(jìn)行檢測,用天然RIC和ABR對(duì)免疫后的Balb/c小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),或收集免疫鼠血清與天然RIC和ABR在體外進(jìn)行中和,分析五種免疫原的免疫保護(hù)效果。 結(jié)果:經(jīng)過PCR和測序驗(yàn)證,所構(gòu)建的突變體基因mABRAE164AR167L、mABRAE164AR167LN200P和mRICAD75AV76MY80A與預(yù)期結(jié)果完全一致,mABRAE164AR167L和mABRAE164AR167LN200P全長753bp,編碼251個(gè)氨基酸殘基,mRICAD75AV76MY80A全長801bp,編碼267個(gè)氨基酸殘基。重組表達(dá)質(zhì)粒pETHis-mABRA1、pETHis-mABRA2、pETHis-mRICA和pET28a-mRICA經(jīng)PCR及雙酶切鑒定證明構(gòu)建正確, mABRA1和mABRA2突變體蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為30 kDa, mRICA突變體蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為32 kDa,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中均以可溶性和包涵體兩種形式表達(dá),可溶性的mABRA1、mABRA2和mRICA經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后,蛋白純度均達(dá)98.5%以上,mABRA1和mABRA2可與抗天然ABR兔多克隆抗體發(fā)生特異抗原抗體反應(yīng),mRICA可與抗天然RIC兔多克隆抗體發(fā)生特異抗原抗體反應(yīng)。所獲得的mRICA/mABRA嵌合體基因經(jīng)一致性比對(duì)分析與預(yù)計(jì)嵌合基因的序列一致性為100%,其開放閱讀框架全長1572 bp,編碼524個(gè)氨基酸殘基。重組表達(dá)質(zhì)粒pQE80L-mRICA/mABRA、pQE30-mRICA/mABRA、pTIGTrx-mRICA/mABRA和pET28a-mRICA/mABRA經(jīng)PCR及雙酶切鑒定證明構(gòu)建正確,嵌合體蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為62 kDa,與預(yù)測的相符,可溶性的嵌合體蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化,純度可達(dá)99%。間接ELISA和WB印跡結(jié)果表明,嵌合體蛋白能同時(shí)與抗RIC兔多克隆抗體和抗ABR兔多克隆抗體發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明,突變體蛋白mRICA的毒性降低到rRICA的1/2500-4100,天然RIC的1/8200-10000,突變體蛋白mABRA1的毒性降低到rABRA的1/1350,天然ABR的1/8000,突變體蛋白mABRA2的毒性降低到rABRA的1/2700-2800,天然ABR的1/16000-17000。 將mRICA、mABRA1、mABRA2蛋白分別免疫Balb/c小鼠,血清中檢測到相應(yīng)的抗mRICA或抗mABRA特異性抗體,將mRICA和mABRA1混合物以及嵌合體蛋白mRICA/mABRA分別免疫Balb/c小鼠,血清中可同時(shí)檢測到抗mRICA和抗mABRA特異性抗體,間接ELISA結(jié)果表明,三免以后血清中相應(yīng)抗體的效價(jià)均可達(dá)到1:106以上,而佐劑對(duì)照組則沒有抗體產(chǎn)生,免疫組和對(duì)照組血清抗體效價(jià)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而兩種免疫途徑,肌肉注射和皮下多點(diǎn)注射所產(chǎn)生的免疫效果沒有明顯差異(p0.05)。用天然RIC和ABR對(duì)免疫小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn),mRICA、mABRA1和mABRA2單獨(dú)免疫組小鼠或抗血清可以抵抗最高劑量為10×LD_(50)的天然毒素的攻擊,保護(hù)率均為100%。mRICA和mABRA1混合物免疫組可以抵抗最高劑量為5×LD_(50)天然RIC和ABR混合物的攻擊,6×LD_(50) RIC和ABR混合物攻擊時(shí)保護(hù)率為80%,8×LD_(50) RIC和ABR混合物攻擊時(shí)保護(hù)率為20%;而mRICA/mABRA嵌合體蛋白免疫組可以抵抗最高劑量為6×LD_(50) RIC和ABR混合物的攻擊,8×LD_(50) RIC和ABR混合物攻擊時(shí)保護(hù)率為60%,mRICA/mABRA嵌合體蛋白可達(dá)到與mRICA和mABRA1混合物同樣的免疫保護(hù)效果。 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建并表達(dá)了突變體蛋白mRICA、mABRA1、mABRA2以及嵌合突變體蛋白mRICA/mABRA,實(shí)現(xiàn)了四種蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的可溶性表達(dá),通過抗原性檢測和細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,所獲得的突變體蛋白和嵌合體蛋白均保留了良好的抗原性,同時(shí)大大降低了毒性,小鼠免疫和攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用構(gòu)建的突變體蛋白和嵌合突變體蛋白作為免疫原作用于機(jī)體產(chǎn)生了良好的免疫刺激作用,免疫后小鼠或抗血清對(duì)致死劑量的天然RIC和ABR毒素的攻毒表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力和較好的免疫保護(hù)效果,為研制新型RIC和ABR疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background : Ricin ( RIC ) and abrin ( abrin , ABR ) are two plant - derived proteins with strong toxicity . Their molecular structure is similar . The total toxin is a heterodimer composed of two disulfide bonds , and the relative molecular mass is between 62 and 67 kDa . The RIC and ABR are considered to be important lethal biological toxin warfare agents and bioterrorism agents . Objective : The purpose of this study was to construct the recombinant protein ( mBRA ) of RIC A - chain mutant ( mABRA ) and ABR A - chain mutant ( mABRA ) , and to realize the soluble expression , rapid purification and antigenic analysis of mBRA mutant protein and mBRA chimeric protein in prokaryotic expression system . It was used as immunogen to evaluate the immune protective effect against natural RIC and ABR poisoning , and to screen out the effective candidate antigen , thus laying the foundation for preparing RIC and ABR A - chain mutant vaccine . coli BL21 ( DE3 ) pLys S / pETHis - mABRA2 . The recombinant expression plasmid pQE80L - mBRA1 and pET28a - mBRA2 were transformed into E . coli BL21 ( DE3 ) pLys S / pETHis - mABRA2 . The recombinant expression plasmid pQE80L - mBRA1 and pET28a - mABRA2 were constructed . The results showed that mABRA1 , mABRA1 , mABRAE164AR167LN200P and mRICAD75AV76MY80A were constructed correctly by PCR and sequencing . The relative molecular mass of mABRA1 , mABRA2 and mABRAE164AR167LN200P was about 801bp . The anti - mAbRA1 , mABRA1 and mABRA1 mixture were challenged with the highest dose of 5 脳 LD _ ( 50 ) RIC and ABR mixture , and the protective rate was 20 % . The mBRA1 and mABRA1 mixture could resist the highest dose of 6 脳 LD _ ( 50 ) RIC and ABR mixture . The protective rate was 60 % when the mixture was challenged with 8 脳 LD _ ( 50 ) RIC and ABR mixture . Conclusion : This study successfully constructed and expressed the mutant protein mRNA, mABRA1 , mABRA2 , and chimeric mutant protein muclei / mABRA . The results showed that the mutant protein and the chimeric protein had good antigenicity . The results showed that the mutant protein and the chimeric protein had good antigenicity . The results showed that the mutant protein and the chimeric mutant protein were used as the immunogen to generate good immune stimulation . The challenge of the immunized mice or the antiserum against the lethal dose of the natural RIC and ABR toxin showed stronger resistance and better immune protection effect , thus laying the important foundation for the development of new RIC and ABR vaccines .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1395969