本文關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激對內(nèi)皮祖細胞作用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析　出處：《吉林大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）可分化為內(nèi)皮細胞，在組織損傷或者缺血時可被募集到損傷部位參與新生血管形成，以此來修復(fù)受損組織。目前的研究顯示在有高脂血癥、高血壓、糖尿病、心臟病或者吸煙的腦血管病高危人群中，外周血EPCs數(shù)量降低、功能減退。它不僅是腦卒中的風(fēng)險及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)，更因其能修復(fù)血管內(nèi)皮、生成新生血管、延緩動脈粥樣硬化斑塊形成、促進神經(jīng)發(fā)生而成為對于急性缺血性腦卒中患者具有治療潛力的一類細胞。 活性氧（reactive oxygen species, ROS）是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的，包括超氧陰離子（Ο2）、過氧化氫（H2O2）、超氧化氫離子（ΗΟ2）和羥自由基（ΟΗ）。許多病理條件例如高脂血癥、高血壓病、糖尿病會增加血管壁ROS的產(chǎn)生。另外，急性組織缺血也會導(dǎo)致微環(huán)境中ROS產(chǎn)生增多。目前的研究顯示EPCs可通過高表達抗氧化酶類來對抗、防御氧化應(yīng)激損傷，已被證實的抗氧化酶包括過氧化氫酶、錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和谷胱甘肽過氧化物酶1（glutathione peroxidase-1，，GPx-1）、血紅素加氧酶1（haemoxygensae1，HO-1）。但是研究顯示在同樣的條件下,聯(lián)合抑制EPCs前3種抗氧化酶后產(chǎn)生的ROS水平仍然較人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs）低,提示還有另外的抗氧化酶在EPCs中發(fā)揮清除ROS的作用。對于氧化損傷機制目前已知的有氧化應(yīng)激使凋亡信號調(diào)控激酶1（apoptosis signal-regulating kinase1，ASK1）活性增高，導(dǎo)致細胞凋亡并由此引起血管形成能力降低。另外細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的增多使人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）活性降低，EPCs血管生成能力降低，同時增加的ROS刺激TERT從細胞核輸出到細胞漿，導(dǎo)致端粒復(fù)制能力降低、延長能力喪失，端�？s短，最終使細胞老化。其他有關(guān)氧化損傷機制的研究大多涉及高糖環(huán)境、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）、血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）等因素導(dǎo)致的ROS升高，并且從這些因素本身對EPCs的影響來推測ROS對EPCs的作用，而對ROS與EPCs功能狀態(tài)的直接作用機制了解甚少。本研究旨在通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為EPCs的抗氧化機制和氧化損傷機制的研究尋找新的線索。 本研究應(yīng)用MTT比色法、劃痕實驗和小管形成實驗對不同濃度（100、200、300和400μM）H2O2對EPCs作用3小時后的細胞數(shù)量、遷移能力和小管形成能力進行了比較，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，細胞數(shù)量減少、遷移和小管形成能力下降，且這種負性作用為劑量依賴性。應(yīng)用二維差異凝膠電泳（two-dimensional differential in-gelelectrophoresis，2D-DIGE）結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI TOF/TOF MS）鑒定的方法對200μM H2O2處理3小時后的EPCs氧化應(yīng)激模型進行了蛋白質(zhì)組的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)了8個有明顯表達差異的蛋白質(zhì)，其中6個表達上調(diào)，2個表達下調(diào)。應(yīng)用2D-Western blot方法選取其中一個蛋白進行驗證，證明了質(zhì)譜鑒定結(jié)果的正確性。EPCs通過高表達抗氧化蛋白過氧化還原酶2（peroxiredoxin-2，Prx-2）、硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶即過氧化還原酶3（thioredoxin-dependent peroxide reductase/peroxiredoxin-3，Prx-3）、過氧化還原酶6（peroxiredoxin-6，Prx-6）和細胞骨架蛋白包含表皮生長因子腓骨蛋白樣細胞外基質(zhì)蛋白1（EGF-containing fibulin-like extracelluarmatrix protein1，EFEMP1）、波形蛋白（vimentin）來防御氧化應(yīng)激損傷。對于氧化損傷的機制，我們的研究發(fā)現(xiàn)抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Rab GDP分離抑制劑α（Rab GDPdissociation inhibitor alpha，Rab GDI α）表達上調(diào)，參與清除氧化核苷酸、減少DNA復(fù)制錯誤的ADP糖焦磷酸酶（ADP-sugar pyrophosphatase，NUDT5）和催化“有氧糖酵解”產(chǎn)生能量的磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TIM）表達均下調(diào)�？梢�，盡管存在防御反應(yīng)（包括抗氧化蛋白和細胞骨架蛋白的表達上調(diào)），由于與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化核苷酸清除、能量產(chǎn)生相關(guān)蛋白的表達改變，EPCs仍表現(xiàn)出數(shù)量減少、遷移和小管形成能力下降。這一發(fā)現(xiàn)提示我們今后在研究保護EPCs免受氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵點的工作中，不能僅僅關(guān)注于防御反應(yīng)蛋白，更要重視像Rab GDIα、NUDT5和TIM這樣的蛋白。因為這些負性通路不能被防御反應(yīng)所保護，也許正是氧化應(yīng)激造成EPCs功能紊亂的關(guān)鍵通路。 本研究采用2D-DIGE結(jié)合MALDI TOF/TOF MS鑒定的方法研究EPCs氧化應(yīng)激模型的蛋白質(zhì)組學(xué)改變，這在國內(nèi)外均未見報道，所鑒定的8個差異表達蛋白在EPCs氧化應(yīng)激的研究中也均未見報道�？寡趸鞍缀图毎羌艿鞍妆磉_上調(diào)的發(fā)現(xiàn)使EPCs抗氧化機制的研究得到進一步完善，而與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化核苷酸清除、能量產(chǎn)生相關(guān)蛋白的表達改變的發(fā)現(xiàn)為EPCs氧化損傷機制的研究提供了新的線索。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 劉守躍;姚春山;關(guān)文明;孟繁凱;胡林森;羅毅男;;腦缺血性疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年05期

2 章波,向渝梅,白云;抗氧化蛋白Peroxiredoxin家族研究進展[J];生理科學(xué)進展;2004年04期

本文編號：1390142