本文關鍵詞：鹽酸小檗堿通過SortaseA和Esp途徑影響糞腸球菌生物被膜的初步探討　出處：《中南大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：1.糞腸球菌生物被膜形成的動態(tài)觀察及早期相關基因的表達研究 目的：建立糞腸球菌生物被膜(biofilm, BF)體外模型,觀察生物被膜形成發(fā)展過程中空間立體結構上的動態(tài)變化；探討sortaseA (轉肽酶A編碼基因)基因、esp(腸球菌表面蛋白)與糞腸球菌生物被膜形成早期的相關性,以利于臨床尋找藥物靶點,提高用藥效率。 方法： (1)臨床篩選并鑒定尿路感染相關性糞腸球菌生物被膜菌,分為生物被膜菌組及生物被膜陰性組,結晶紫染色法定量檢測生物被膜量。 (2)采用玻片法體外建立糞腸球菌生物被膜模型,分別培養(yǎng)1、8、16、24、48及72h,利用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)及熒光顯微鏡動態(tài)觀察生物被膜形成發(fā)展過程中的空間結構變化。 (3)利用實時定量PCR方法相對定量檢測esp、 sortaseA在生物被膜早期菌和生物被膜陰性菌中的表達差異,做統(tǒng)計學分析。 結果： (1)本院99例尿路感染患者導尿管中共篩選出生物被膜菌36株,陽性率36.4%。其中糞腸球菌占生物被膜菌的27.8%。 (2)結晶紫染色定量顯示菌株在1、8、16h生物被膜逐漸形成,24h趨于頂峰,隨后生物被膜量回落,48h有減少,72h進一步減少。 (3)菌株培養(yǎng)在16小時基本形成,24小時成熟,48小時有播散。隨著生物被膜形成過程的進展,死菌量及活菌量逐漸增多,到48h開始有所減少；細菌總量由粘附面到游離面逐漸減少；中間層活菌量密度最高。 (4) sortaseA、 esp基因的表達與糞腸球生物被膜菌形成早期具有相關性。生物被膜早期菌組sortaseA、 esp表達量分別是生物被膜陰性菌組的7.9與13.5倍。 小結： (1)本研究細菌尿路感染中,生物被膜菌檢出率為36.3%.其中以糞腸球菌所占生物被膜菌比例最大(27.8%)。這一結果與我們實驗室三年前研究的結論基本一致,提示本院在近三年留置導尿管相關的尿路感染生物被膜菌分布變化不明顯。 (2)利用熒光顯微鏡及CLSM觀察,證實了糞腸球菌BF形成和發(fā)展經歷了最初的定植及不可逆黏附等早期階段、結構分化階段、發(fā)展成熟階段、和解聚再定植階段。細菌總量由粘附面到游離面逐漸減少；中間層活菌量密度較高。 (3)sortaseA、 esp基因與糞腸球生物被膜菌形成早期密切相關,在生物被膜形成早期上調。 2.鹽酸小檗堿對糞腸球菌生物被膜形成的影響 目的：研究鹽酸小檗堿對糞腸球菌生物被膜形成的影響,并探討其作用機制。 方法：以生物被膜量較強的菌株EF06為研究對象,將鹽酸小檗堿處理菌株EF06的不同分為兩組,甲組為不同濃度鹽酸小檗堿與EF06共同孵育24h；乙組為EF06培養(yǎng)24h后與不同濃度鹽酸小檗堿再共培24h。熒光顯微鏡觀察藥物未處理組和處理組之間的差異。結晶紫染色法定量檢測不同處理組內生物被膜形成量和生物被膜量的差異,做統(tǒng)計學分析。 結果： (1)熒光顯微鏡檢測,甲處理組中鹽酸小檗堿作用濃度在20μg/ml和40μg/ml時,EF06細菌密度略高于藥物未處理組,但隨著藥物濃度的增加,細菌密度逐漸減少。乙處理組鹽酸小檗堿作用濃度在200,400和600μg/ml時,生物被膜結構上未見明顯的變化,當達到800μg/ml時生物被膜厚度有所減少,達到1000瞻/ml,生物被膜厚度減少明顯。 (2)結晶紫染色定量測得OD600值。在甲組,藥物濃度為20、40μg/ml與0μg/ml比較,p0.05；藥物濃度60、80和100μg/ml與0μg/ml比較,p0.05；藥物濃度60、80與100μg/ml之間兩兩比較,p0.05,前者大于后者。在乙組,藥物濃度為200、400及600μg/ml與0μg/ml比較,p0.05,藥物濃度800和1000μg/ml與0μg/ml比較,p0.05,藥物濃度800與1000μg/ml比較,p0.05,前者大于后者。 小結： (1)鹽酸小檗堿對糞腸球菌生物被膜的形成有抑制作用,藥物濃度達到60μg/ml后,其抑制作用與藥物作用濃度成正相關。 (2)鹽酸小檗堿降低糞腸球菌生物被膜量,濃度從800μg/ml開始,隨著濃度增加,生物被膜量逐漸減少。
[Abstract]:Study on the dynamic observation of biofilm formation of 1. Enterococcus faecalis and the expression of early related genes
Objective: to establish the Enterococcus faecalis biofilm (biofilm, BF) in vitro model, observe bio dynamic changes of space in the process of the development of three-dimensional structure of film forming; sortaseA (GGT gene encoding A gene (ESP), enterococcal surface protein) and Enterococcus faecalis biofilm formation in early correlation to clinical searching for drug targets, improve administration efficiency.
Method錛，

本文編號：1390035