本文關(guān)鍵詞：海馬神經(jīng)元雄激素膜受體的定位及其快速作用　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：以原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元為研究對象，觀察睪酮-牛血清白蛋白-異硫氰酸熒光素（T-BSA-FITC）與海馬神經(jīng)元胞膜結(jié)合情況，驗證海馬神經(jīng)元細胞膜雄激素特異性結(jié)合位點（膜受體）的存在；研究睪酮對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元Ca~2+和鈣調(diào)蛋白（CaM）的快速作用，為海馬神經(jīng)元雄激素膜受體介導(dǎo)的非基因組作用研究提供實驗依據(jù)。 方法： 1、原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)、形態(tài)觀察及鑒定：新生1d內(nèi)SD大鼠乳鼠，無菌條件下斷頭取腦，剝離海馬，去除血管和軟腦膜，剪碎海馬組織，胰酶消化。DMEM（10%NBCS）終止消化。機械性分散成單細胞懸液，以5～10×10~5/ml密度接種于包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板上。細胞在CO_2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，培養(yǎng)24h內(nèi)，更換培養(yǎng)基為含L-谷氨酰胺和2%B27的Neurobasal。MTT法繪制細胞生長曲線，細胞免疫熒光化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元及其純度。 2、海馬神經(jīng)元雄激素膜受體定位研究：取培養(yǎng)8～10天的原代海馬神經(jīng)元，加入T-BSA-FITC37°C作用15min，激光共聚焦顯微鏡下觀察雄激素復(fù)合物的亞細胞定位。BSA-FITC作為陰性對照組。另設(shè)競爭性實驗，用過量游離T提前作用神經(jīng)元15min后再加入T-BSA-FITC繼續(xù)作用15min，觀察T-BSA-FITC與胞膜結(jié)合情況，驗證海馬神經(jīng)元是否存在雄激素膜受體。 3、研究雄激素對海馬神經(jīng)元Ca~2+的快速作用：Ca~2+敏感熒光染料Fluo4-AM對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元進行負載，激光共聚焦顯微鏡記錄10~-7MT干預(yù)前后細胞內(nèi)Ca~2+的變化。每隔2s記錄一次，共記錄30min。 4、研究雄激素對海馬神經(jīng)元CaM的快速作用：應(yīng)用免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)觀察10~-7M T作用于海馬神經(jīng)元0min、15min、30min、1h和2h CaM的表達情況。 結(jié)果： 1、原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，6～8h開始貼壁，培養(yǎng)24h后大部分神經(jīng)元貼壁并伸出突起，培養(yǎng)3d神經(jīng)元突起增多并延長。隨著培養(yǎng)時間延長，胞體增大，豐滿，突起進一步增粗延長，交織成網(wǎng)絡(luò)。細胞呈多極神經(jīng)元，形態(tài)多樣，有錐形、三角形、梭形、橢圓形等等。培養(yǎng)3w后，細胞開始退化，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆�？张�，，突起退化、核固縮崩解。MTT法繪制生長曲線：潛伏生長期（2～4d）,生長期（4～10d），此時細胞生長較快，發(fā)育成熟，之后處于達到平穩(wěn)狀態(tài)（11d～）。經(jīng)NeuN免疫細胞化學(xué)染色，Hoechst33258復(fù)染細胞核，證明是神經(jīng)元，計數(shù)陽性細胞率大于95%。 2、海馬神經(jīng)元雄激素膜受體定位研究結(jié)果：T-BSA-FITC組，部分神經(jīng)元胞膜上有特異性熒光，其神經(jīng)突起起始部亦有熒光，而內(nèi)部無特異性標記。在同樣孵育條件下BSA-FITC沒有結(jié)合到神經(jīng)元上。游離T預(yù)先孵育幾乎未檢測到任何熒光染色，表明T預(yù)先孵育可以完全阻斷T-BSA-FITC膜結(jié)合作用。 3、雄激素對海馬神經(jīng)元Ca~2+的快速作用研究結(jié)果：原代海馬神經(jīng)元Fluo4-AM鈣探針負載，激光共聚焦顯微鏡下給予T處理，部分神經(jīng)元在給藥后數(shù)分鐘內(nèi)細胞內(nèi)鈣有增高，并可誘發(fā)出細胞內(nèi)鈣波動，峰值較基礎(chǔ)值增高3.45±0.20倍，且峰值出現(xiàn)在給藥后20min內(nèi)。 4、雄激素對海馬神經(jīng)元CaM的快速作用研究結(jié)果：T干預(yù)各時間組CaM熒光強度較0min組（46.49±1.15）均增加（P0.05）。其中15min組（101.74±2.88）和30min組（103.27±2.80）熒光強度增加明顯；1h組（85.10±2.23）和2h（81.65±1.68）組熒光強度增加程度弱于15min組和30min組（P0.05）。 結(jié)論: 1、出生24h以內(nèi)的SD大鼠乳鼠，體外無血清培養(yǎng)技術(shù)可以成功培養(yǎng)出原代海馬神經(jīng)元，經(jīng)鑒定細胞純度達到95%以上，培養(yǎng)8～10d可用于實驗。 2、海馬神經(jīng)元細胞膜存在睪酮特異性結(jié)合位點（膜受體），且該位點可以被游離T競爭性結(jié)合。 3、T作用于原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可以引起部分細胞內(nèi)Ca~2+和CaM的快速變化，其作用可能是通過雄激素膜受體介導(dǎo)的快速非基因組效應(yīng)實現(xiàn)的。
[Abstract]:Objective: primary cultured hippocampal neurons as the research object, testosterone - bovine serum albumin - fluorescein isothiocyanate (T-BSA-FITC) combined with hippocampal neuronal membrane, validate androgen specific membrane binding sites in hippocampal neurons (membrane receptors) exist; the research of testosterone Ca~2+ and calmodulin on primary cultured hippocampal neurons (CaM) the rapid effect, to provide the experimental basis for the study of nongenomic effects of hippocampal neurons of androgen receptor mediated.
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本文編號：1386131