本文關(guān)鍵詞：脈沖場凝膠電泳構(gòu)建非點源污染指示菌E. coliDNA指紋圖譜及貝類微生物源示蹤研究　出處：《浙江工商大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：海產(chǎn)品因其營養(yǎng)豐富、味道鮮美,一直被人們視為食之上品。而其中又以海貝尤甚,其低脂肪、高蛋白、同時又富含多不飽和脂肪酸和鋅等微量元素,被稱為“海之珍品”。然而隨著沿港規(guī)�；笄蒺B(yǎng)殖業(yè)對環(huán)境污染問題的日益突出,農(nóng)業(yè)非點源污染——畜禽廢棄物污染已成為近岸海水、灘涂養(yǎng)殖水產(chǎn)品的主要污染源之一,這對于沿岸沿港的灘涂貝類養(yǎng)殖產(chǎn)生了極大的威脅,這是因為貝類是濾食性生物,能夠富集養(yǎng)殖環(huán)境中的各種污染物,包括病原微生物及其它有毒有害物質(zhì)。一旦其生長環(huán)境遭到污染,作為食物鏈頂端的消費人群將直接面臨疾病的威脅,特別是喜食生鮮貝類的沿海消費人群,在食用這些不潔的貝類后極易引發(fā)各種腹痛、嘔吐、便血等癥狀,嚴(yán)重時甚至還會危及生命。因此我們認(rèn)為十分有必要建立一個系統(tǒng)、有效、科學(xué)的貝類產(chǎn)品養(yǎng)殖監(jiān)管體系來保證這種高價值商品的生產(chǎn)養(yǎng)殖,從而保證消費的安全與可靠。本文擬通過構(gòu)建不同來源的糞污染指示物大腸埃希氏桿菌(E. coli)的脈沖場凝膠電泳(PFGE)指紋圖譜庫,探究該方法應(yīng)用于貝類食品及其養(yǎng)殖環(huán)境安全的微生物源示蹤(MST),同時為水產(chǎn)品及其相關(guān)養(yǎng)殖水體環(huán)境監(jiān)管體系的建立提供理論支撐和科學(xué)依據(jù),進(jìn)而保證水產(chǎn)貝類的安全生產(chǎn)與消費。 本課題以東海象山港沿岸灘涂及周邊海域為實驗海域,經(jīng)實地考察調(diào)研后最終確定象山港區(qū)域的西滬港、蟹鉗港及大目涂貝類養(yǎng)殖場附近的畜禽養(yǎng)殖場為糞源采樣點(已知污染來源的采樣點),而將糞源采樣點附近(主要以上、中、下游為主)的灘涂貝類養(yǎng)殖場及相關(guān)水域列為未知污染來源的采樣點,采集得到的各種樣品經(jīng)前期各種選擇性培養(yǎng)基(麥康凱瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基等)的分離純化得到疑似E. coli菌株,接著通過后期的一系列生化反應(yīng)鑒定后得到最終的分離株。E. coli DNA的包埋抽提則采用CHEF Genomic DNA Plug Kit試劑盒,提取的基因組DNA經(jīng)稀有切點限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行PFGE,電泳圖譜結(jié)果的聚類分析和Jackknife分析(RCC/RACC)采用Quantity One、InfoQuest?、SPSS等數(shù)據(jù)分析軟件,最后建立東海灘涂已知來源E. coli DNA的PFGE指紋圖譜數(shù)據(jù)庫,同時對所建立的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行穩(wěn)定性評價。此外,將分離自未知來源E. coli(分離自相關(guān)的貝樣和水樣)的DNA也采用PFGE指紋圖譜分析,與已知源數(shù)據(jù)庫中的指紋圖譜進(jìn)行比對分析后,同時結(jié)合多維尺度分析(ALSCAL),最終判定未知來源E. coli的最可能原始來源,進(jìn)而探究PFGE這一MST方法應(yīng)用于貝類食品及其養(yǎng)殖水環(huán)境安全溯源的可行性和科學(xué)性。 采樣共采集得到鴨糞、鵝糞、雞糞和豬糞各40份,總計160份糞便樣品；另外在各個港口采集貝類樣品各20或40份,總計100份貝樣；各個采樣點的水樣按照上、中、下游分別采集,共采集得到水樣60份。糞樣經(jīng)分離后得到鴨源、鵝源、雞源和豬源的疑似E. coli分離株數(shù)分別為112、77、86和98株；經(jīng)生化鑒定和API20E鑒定后的實際E. coli菌株數(shù)分別為91、65、79和83株,得到4種來源的E. coli鑒出率分別為：鴨源E. coli81.25%、鵝源E. coli84.42%、雞源E. coli91.86%、豬源E. coli84.69%。對PFGE實驗方法的優(yōu)化試驗中得出：DNA的包埋量在2.3～5.04*108/ml plugs,即OD600值在1.0-1.4之間,蛋白酶K消化時間選擇10hrs,脈沖凝膠電泳參數(shù)選擇電壓梯度6V/cm,電泳角度120°,起始轉(zhuǎn)換時間分別為O.1s和39s,a值為0(線性相關(guān)),電泳緩沖液溫度14℃,電泳時間21.3hrs,圖譜條帶分離度與多態(tài)性最佳。對指紋圖譜傳代穩(wěn)定性評價得出：兩株試驗菌株(CICC21524和XQ201006SWINE01)在傳代15代后,PFGE指紋圖譜的最低相似系數(shù)均在0.90左右,表明對圖譜的穩(wěn)定性影響不大；指紋圖譜的穩(wěn)定性評價得出：Xba I限制性酶切穩(wěn)定性也較好,最低相似系數(shù)為0.91；脈沖電泳檢測的穩(wěn)定性試驗得出連續(xù)三次水平脈沖電泳,其差異都很小,這兩個試驗說明指紋圖譜具有良好的穩(wěn)定性。PFGE指紋圖譜庫的構(gòu)建得出：經(jīng)聚類分析后,PFGE指紋圖譜共有69種聚類數(shù),其中包括8種錯誤聚類數(shù)；鴨源、鵝源、雞源和豬源E. coli的指紋圖譜正確判別率(RCC)值分別為91.21%、92.31%、88.61%和92.77%,平均正確判別率(ARCC)值為91.23%；根據(jù)上述所建立的已知源指紋圖譜庫對分離于東海灘涂貝樣及相關(guān)水域水樣的未知來源E. coli菌株進(jìn)行判別分析,結(jié)果得到貝樣正確判別菌株26株,溯源鑒出率為29.89%(26/87),水樣正確判別菌株為13株,溯源鑒出率為17.57%(13/74)。 得到以下結(jié)論：1.糞源指示因子E. coli的分離鑒定方法有效可靠,為后續(xù)指紋圖譜庫的建立提供了大量試驗素材。2. PFGE指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性,分離得到的E. coli在20代內(nèi)具有良好的傳代穩(wěn)定性,從而保證圖譜庫的穩(wěn)定性。3. PFGE的優(yōu)化條件具有良好的重復(fù)性和可操作性,是后續(xù)得到穩(wěn)定實驗結(jié)果的可靠保證。4.聚類分析方法結(jié)合ALSCAL/MDS分析方法對未知來源的菌株具有較高的正確判別率,這為貝類食品安全微生物源示蹤體系的構(gòu)建提供了可行的方法。
[Abstract]:Because of its rich nutrition and delicious taste , marine products have been regarded as food products . The pollution of agricultural non - point source pollution _ livestock and poultry wastes has become one of the main sources of pollution in coastal waters and tidal flats . In this paper , the samples collected from E . coli isolated from the unknown source were analyzed by means of a series of selective media ( MacConkey agar , lactose bile salt fermentation , eosin methylene blue agar culture medium , etc . ) . The results of the analysis and Jackknife analysis ( RCC / RACC ) were used to determine the most probable origin of E . coli . The samples were collected and collected in 40 parts of duck manure , goose manure , chicken manure and pig manure for a total of 160 parts of stool samples , and 20 or 40 parts of shellfish samples were collected at various ports , and 60 parts of water samples were collected respectively . The results showed that the minimum similarity coefficient of PFGE fingerprint was 0 . 90 % , 92 . 31 % , 88.61 % and 92.77 % , respectively . The following conclusions are obtained : 1 . The isolation and identification method of fecal source indicator E . coli is effective and reliable , which provides a lot of experimental material for the establishment of the subsequent fingerprint library . The PFGE fingerprint has better stability , and the obtained E . coli has good passage stability in 20 generations , thus ensuring the stability of the atlas database . The optimization condition of PFGE has good repeatability and operability . It is a reliable guarantee for the subsequent stable experimental results . 4 . Cluster analysis method combined with ALSCAL / MDS analysis method has high correct judgment rate for the unknown source strains , which provides a feasible method for the construction of the source tracing system of food safety .

【學(xué)位授予單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1378189