本文關(guān)鍵詞：Notch-p18信號通路調(diào)控造血干細(xì)胞功能的研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景：造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell, HSC)存在于骨髓、胚胎肝、脾臟、外周血及臍帶血等多種組織部位,是生成各種血細(xì)胞的起始細(xì)胞,并具有高度自我更新能力。在臨床上,HSC已廣泛和有效的應(yīng)用于干細(xì)胞移植、生物免疫治療和造血支持治療等領(lǐng)域。但影響HSC自我更新及多向分化的機(jī)制還有待研究。Notch受體在造血干、祖細(xì)胞高表達(dá),但Notch信號通路影響HSC自我更新和多向分化的機(jī)制還不清楚。我們實(shí)驗(yàn)室前期工作提示Notch可以下調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白p18。本研究擬通過Notch受體激活所必需的胞內(nèi)片段切割酶y-Secretase抑制化合物DAPT (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L:-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester)和p18蛋白阻斷劑(3#小分子化合物)分別及共同作用于小鼠骨髓HSC,系統(tǒng)深入研究Notch信號通路影響HSC的機(jī)制,為HSC體外擴(kuò)增和HSC的骨髓移植提供新的科學(xué)依據(jù)(圖1)。 目的：研究Notch-p18信號通路對HSC功能的影響。 方法： (1)DAPT體外作用小鼠骨髓細(xì)胞,研究Notch信號通路對HSC功能的影響。DAPT阻斷小鼠骨髓細(xì)胞的Notch信號通路后,用RT-PCR檢測小鼠骨髓HSC的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量變化；流式細(xì)胞儀分析檢測小鼠骨髓HSC的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化；單個HSC培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測HSC的增殖及分化能力的變化以及體外長周期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測HSC的擴(kuò)增潛能。 (2)p18蛋白抑制劑處理小鼠骨髓細(xì)胞,研究p18抑制劑對小鼠骨髓HSC的影響。流式細(xì)胞儀分析檢測小鼠骨髓HSC的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化；用RT-PCR檢測小鼠骨髓HSC中細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的變化；活細(xì)胞工作站觀察小鼠骨髓HSC分裂時間的變化。 (3)我們采用DAPT和p18蛋白抑制劑分別及共同作用于與MS5-Deltal細(xì)胞系共培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞,進(jìn)一步研究Notch-p18信號通路在HSC的調(diào)控中的作用。MS5-Deltal細(xì)胞系(Deltal為Notch受體的配體)與小鼠骨髓細(xì)胞共培養(yǎng),可激活Notch信號通路。利用DAPT和p18蛋白抑制劑分別及共同作用于以MS5-Deltal細(xì)胞系為基質(zhì)共培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞,體外長周期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠骨髓HSC活性的變化、單個HSC培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測HSC分化能力的變化及競爭性骨髓移植實(shí)驗(yàn)檢測HSC重建能力的變化；RT-PCR檢測小鼠骨髓HSC中Notch信號通路相關(guān)基因Notch1、CSL、HES1和p18mRNA表達(dá)量的變化。 結(jié)果： (1)1μM的DAPT可有效阻斷Notch受體胞內(nèi)段的切割。RT-PCR結(jié)果顯示：DAPT作用于LKS細(xì)胞,小鼠骨髓細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK1、CDK2、CDK4、CDK6及p27的mRNA表達(dá)量升高,p18和p21基因的mRNA表達(dá)量降低,凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、p53、Puma的mRNA表達(dá)量升高,Bim基因的mRNA表達(dá)量降低。DAPT處理小鼠骨髓細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析檢測結(jié)果為：CD34-Lin-c-kit+Sca-1+(CD34-LKS)細(xì)胞的Go期細(xì)胞減少,G1期細(xì)胞增多；HSC的細(xì)胞凋亡增多。體外長周期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明HSC的擴(kuò)增能力下降。 (2)20μM的p18抑制劑(3#小分子化合物),可有效作用于小鼠骨髓細(xì)胞。p18抑制劑處理骨髓細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀分析檢測發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓HSC的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡無變化。LKS細(xì)胞加p18抑制劑處理后,RT-PCR結(jié)果顯示CDK2、CDK6基因的mRNA表達(dá)量升高；活細(xì)胞工作站發(fā)現(xiàn)p18抑制劑加速了單個HSC子細(xì)胞分裂,縮短了子細(xì)胞的分裂時間的間隔。 (3)1μM的DAPT和20μM的p18抑制劑分別及同時作用于以MS5-Deltal細(xì)胞系為基質(zhì)共培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞,體外長周期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明p18抑制劑組HSC的擴(kuò)增能力增強(qiáng),DAPT組HSC的擴(kuò)增能力下降,p18抑制劑和DAPT組HSC的擴(kuò)增能力增強(qiáng),但低于p18抑制劑組,高于DAPT組。 單個HSC與DAPT、p18抑制劑或二者共同培養(yǎng)十天,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p18抑制劑促進(jìn)HSC向單核和巨噬細(xì)胞方向分化,DAPT促進(jìn)其向粒細(xì)胞方向分化。 競爭性骨髓移植實(shí)驗(yàn)說明,在移植一個月后,各組之間供體細(xì)胞的重建率和供體細(xì)胞的各系分化情況沒差別。 RT-PCR結(jié)果顯示：小鼠骨髓LKS細(xì)胞加DAPT處理后,HES1基因的mRNA表達(dá)量降低,p18基因的mRNA表達(dá)量升高,細(xì)胞周期相關(guān)基因p21、CDK1、CDK4的mRNA表達(dá)量升高。小鼠骨髓LKS細(xì)胞加p18抑制劑處理后,Notch1、CSL、 HES1、p18基因的mRNA表達(dá)量不變。小鼠骨髓LKS細(xì)胞加p18抑制劑和DAPT同時處理后,HES1基因的mRNA表達(dá)量降低,p18基因的mRNA表達(dá)量升高。 結(jié)論： (1) DAPT阻斷Notch信號通路后,加速了小鼠骨髓HSC的耗竭及凋亡,降低了小鼠骨髓HSC的擴(kuò)增能力。 (2)p18蛋白抑制劑對小鼠骨髓HSC的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡無影響。 (3) Notch信號通路可能是通過上調(diào)HES1表達(dá),進(jìn)而下調(diào)p18蛋白表達(dá)來調(diào)節(jié)小鼠骨髓HSC功能的。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2

【共引文獻(xiàn)】

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1 徐春燕;耿珊;劉俊;朱家紅;張先平;姜蓉;王亞平;;當(dāng)歸多糖聯(lián)合阿糖胞苷誘導(dǎo)人白血病KG1α細(xì)胞株衰老的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國中藥雜志;2014年07期

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本文編號：1373706