本文關(guān)鍵詞：MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒疫苗研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：流行性感冒簡稱流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感的發(fā)病率為各種傳染性疾病之首,是嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病之一。據(jù)2011年世界衛(wèi)生組織報(bào)告,全球每年約有6億～l2億人感染流感,其中死亡50萬～100萬人。甲型流感病毒常引起世界性流感大流行,對人類威脅極大。眾所周知,上世紀(jì)爆發(fā)的“西班牙流感”、“亞洲流感”、“香港流感”三次大流感流行,分別由甲型H1N1、甲型H2N2和甲型H3N2亞型流感病毒引起,造成了數(shù)千萬人死亡,給人類健康和經(jīng)濟(jì)造成了巨大危害和損失。隨著全球氣候和生態(tài)環(huán)境變化,流感對人類健康和公共衛(wèi)生安全危害日益嚴(yán)重,特別是近年來人感染高致病性H5N1禽流感,以及2009年在墨西哥爆發(fā)的甲型H1N1流感,再一次給人們敲響了警鐘,人類流感的防控極其重要。 接種疫苗是防控流感爆發(fā)最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。目前,流感疫苗主要的生產(chǎn)介質(zhì)是雞胚,然而雞胚來源的疫苗存在著質(zhì)量難以控制、生產(chǎn)周期長、易引起過敏,一旦流感爆發(fā)其來源將成為瓶頸,無法及時(shí)應(yīng)對流感疫情等問題。因此,開發(fā)新的人用流感疫苗生產(chǎn)介質(zhì)已成為疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵,WHO推薦細(xì)胞是生產(chǎn)疫苗的優(yōu)良介質(zhì)。采用細(xì)胞進(jìn)行流感疫苗的發(fā)酵生產(chǎn),其質(zhì)量可控性好,封閉的生產(chǎn)體系方便安全,可以根據(jù)需求大批量發(fā)酵生產(chǎn),避免了由于流感大流行造成雞胚供應(yīng)不足而影響疫苗產(chǎn)量的缺點(diǎn)。目前,獲準(zhǔn)生產(chǎn)人用流感疫苗的細(xì)胞系主要有Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞。據(jù)報(bào)道,已有企業(yè)利用Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞通過微載體系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)制備人用流感疫苗。Baxter公司已經(jīng)于2009年通過Vero細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)生產(chǎn)了禽流感疫苗CELVAPAN并上市,Novartis公司于2007年用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)了流感疫苗Optaflu并上市,同時(shí)Novartis公司于2009年又通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)了甲型H1N1流感疫苗。 采用細(xì)胞進(jìn)行流感疫苗的制備,存在的主要問題是流感病毒產(chǎn)量低。人流感病毒主要通過結(jié)合到細(xì)胞表面的唾液酸寡糖上進(jìn)行吸附感染,該唾液酸寡糖類型是N-乙酰唾液酸末端通過α2,6糖苷鍵連接到半乳糖上的(NeuAcα2,6 Gal)。雖然MDCK細(xì)胞和Vero細(xì)胞表面都有這種類型的唾液酸寡糖,但是豐度并不高。同時(shí),細(xì)胞表面流感病毒受體的類型和數(shù)量存在著個(gè)體差異。另外,流感病毒在不同的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制效率的高低也可能存在著個(gè)體化差異。所以可以通過篩選單克隆細(xì)胞株的方法來獲得流感病毒適應(yīng)性細(xì)胞。由于MDCK細(xì)胞對流感病毒的適應(yīng)性要好于Vero細(xì)胞,所以可以篩選MDCK單克隆細(xì)胞株來獲得對流感病毒高產(chǎn)的細(xì)胞株,以實(shí)現(xiàn)流感病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠高效復(fù)制擴(kuò)增的目的。 為了實(shí)現(xiàn)利用細(xì)胞代替雞胚來生產(chǎn)制備流感疫苗的目的,我們篩選獲得能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細(xì)胞株和病毒株,進(jìn)而優(yōu)化細(xì)胞和病毒培養(yǎng)條件,并進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗。我們通過兩方面進(jìn)行篩選:第一,通過有限稀釋法制備單克隆細(xì)胞株,使用流感病毒進(jìn)行感染,從而篩選出適應(yīng)流感病毒的單克隆細(xì)胞株;第二,篩選流感病毒株,用不同的流感病毒株感染單克隆MDCK細(xì)胞株,篩選出可以產(chǎn)生較高病毒滴度的流感病毒株。通過以上兩方面的篩選,獲得能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細(xì)胞株和病毒株,并進(jìn)一步經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化,擴(kuò)大培養(yǎng),為使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗奠定基礎(chǔ),為流感爆發(fā),能夠及時(shí)大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗提供了技術(shù)保證,因此具有重大意義。 本課題的研究目的主要是通過有限稀釋法制備單克隆細(xì)胞株,篩選出適應(yīng)流感病毒高滴度復(fù)制的單克隆細(xì)胞株;用不同的流感病毒株感染單克隆細(xì)胞株,篩選出能產(chǎn)生較高病毒滴度的流感病毒株;將篩選獲得的單克隆細(xì)胞株和流感病毒株進(jìn)行條件優(yōu)化,擴(kuò)大培養(yǎng),從而制備流感疫苗,為細(xì)胞代替雞胚大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗奠定基礎(chǔ)。 本研究主要包括以下三個(gè)部分: 第一、甲型H1N1流感病毒株和MDCK單克隆細(xì)胞株的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化。通過有限稀釋法制備MDCK單克隆細(xì)胞株,建立MDCK單克隆細(xì)胞庫。使用不同的甲型H1N1流感病毒株感染MDCK單克隆細(xì)胞株,通過血凝滴度檢測篩選出能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細(xì)胞株和病毒株。經(jīng)篩選后獲得能產(chǎn)生較高病毒滴度的細(xì)胞株和病毒株分別為M77單克隆細(xì)胞株和甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009。對篩選到的細(xì)胞株和病毒株進(jìn)行TCID50滴度測定、空斑形成試驗(yàn)、細(xì)胞表面NeuAcα2,6 Gal豐度測定、細(xì)胞株遺傳穩(wěn)定性等檢測。結(jié)果顯示,M77細(xì)胞株較普通MDCK細(xì)胞能顯著提高流感病毒滴度。將篩選到的細(xì)胞株建立MDCK細(xì)胞庫并進(jìn)行細(xì)胞庫檢定,將篩選到的病毒株建立甲型H1N1流感病毒庫并進(jìn)行病毒庫檢定,均符合要求。然后對病毒培養(yǎng)條件,包括細(xì)胞豐度、病毒稀釋液、病毒感染劑量(MOI)、培養(yǎng)溫度、病毒收獲時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件為:接種病毒時(shí)細(xì)胞豐度選擇100%,采用無血清的DMEM培養(yǎng)基(含1μg/ml的TPCK-胰酶),MOI選擇0.001,培養(yǎng)溫度選擇37℃,病毒收獲時(shí)間選擇感染后72h～96h。以上條件優(yōu)化,為甲型H1N1流感病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)提供了技術(shù)保證。 第二、甲型H1N1流感病毒在MDCK細(xì)胞上的擴(kuò)大培養(yǎng)、濃縮純化及檢測鑒定。將篩選到的甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009感染篩選到的MDCK單克隆細(xì)胞株M77,采用優(yōu)化了的較佳培養(yǎng)條件,依次在細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠和發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),結(jié)果都較理想。將擴(kuò)大培養(yǎng)收集的病毒收獲液通過1: 4000的甲醛滅活、10KD的膜包濃縮、30%與60%的蔗糖密度梯度離心純化、0.5%的Triton X-100裂解,并對純化前后的甲型H1N1病毒樣品進(jìn)行電鏡觀察、血凝滴度、總蛋白含量、HA抗原含量、DNA殘留量等進(jìn)行測定。結(jié)果顯示,經(jīng)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒具典型流感病毒特征,純度達(dá)到98.3235%,雜蛋白去除率為98.30%,HA的回收率為40%,經(jīng)處理后DNA殘留量低于100 pg/劑。 第三、細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗的免疫效果評價(jià)。將由MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒進(jìn)行純化后,制備成甲型H1N1流感裂解疫苗。將6周齡的雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分組,每組12只,分為PBS對照組、雞胚來源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫組和細(xì)胞來源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫組。每只小鼠肌肉注射接種HA抗原15μg,注射量為200μl/只。第一次免疫后兩周進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫。分別在一免一周、一免二周、二免一周和二免二周對小鼠進(jìn)行尾靜脈采血,檢測其血清中抗體IgG,IgG1,IgG 2a以及IgG 2b的滴度和HI滴度,并且檢測其血清中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的滴度以及小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中分泌IL-4和IFN-γ的細(xì)胞頻數(shù)水平。用甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009和病毒株A/PR/8/34對二免二周的小鼠進(jìn)行滴鼻攻毒實(shí)驗(yàn),評價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗對小鼠的免疫保護(hù)性及交叉保護(hù)性。結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗與雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗都能激活較高的體液免疫水平,且細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗比雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗要更高。細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗和雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗對小鼠的免疫保護(hù)性都能達(dá)到100%。交叉保護(hù)性實(shí)驗(yàn)顯示,細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗比雞胚來源的流感裂解疫苗具有更好的交叉保護(hù)性。 結(jié)論:采用單克隆細(xì)胞株篩選的方法可以獲得能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細(xì)胞株,經(jīng)病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化后擴(kuò)大培養(yǎng),可以獲得理想的病毒產(chǎn)量。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感疫苗具有很好的免疫效果、較高的免疫保護(hù)性及交叉保護(hù)性。為發(fā)展MDCK細(xì)胞規(guī)�；a(chǎn)流感疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳少慧;舒躍龍;;Vero細(xì)胞流感疫苗應(yīng)用前景[J];病毒學(xué)報(bào);2006年01期

2 張德禮,李六金,夏耕田,何旭玉,高步先,白曉鴻,黃高升,劉尚高,閻隆飛,方福德,胡春雷,王黎軍,姜煥宏,馮阿曼,張廣民,安社剛,任遠(yuǎn)強(qiáng),郭建民,胡淑賢,樊軍喜,牛永利,宋占軍,李迎,樊勝軍;動(dòng)物細(xì)胞系的染色體組型與遺傳變異率分析[J];遺傳學(xué)報(bào);2001年04期

3 李仁清,阮力;流感疫苗研究進(jìn)展[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2004年02期

4 呂宏亮;付秀花;鄭明;;傳代細(xì)胞制備流感病毒疫苗工藝研究進(jìn)展[J];中國獸藥雜志;2009年06期

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1 王俊鳴;[N];科技日報(bào);2006年

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