本文關(guān)鍵詞：MDCK細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒疫苗研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：流行性感冒簡稱流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感的發(fā)病率為各種傳染性疾病之首,是嚴重危害人類健康的重要傳染病之一。據(jù)2011年世界衛(wèi)生組織報告,全球每年約有6億～l2億人感染流感,其中死亡50萬～100萬人。甲型流感病毒常引起世界性流感大流行,對人類威脅極大。眾所周知,上世紀爆發(fā)的“西班牙流感”、“亞洲流感”、“香港流感”三次大流感流行,分別由甲型H1N1、甲型H2N2和甲型H3N2亞型流感病毒引起,造成了數(shù)千萬人死亡,給人類健康和經(jīng)濟造成了巨大危害和損失。隨著全球氣候和生態(tài)環(huán)境變化,流感對人類健康和公共衛(wèi)生安全危害日益嚴重,特別是近年來人感染高致病性H5N1禽流感,以及2009年在墨西哥爆發(fā)的甲型H1N1流感,再一次給人們敲響了警鐘,人類流感的防控極其重要。 接種疫苗是防控流感爆發(fā)最經(jīng)濟、有效的手段。目前,流感疫苗主要的生產(chǎn)介質(zhì)是雞胚,然而雞胚來源的疫苗存在著質(zhì)量難以控制、生產(chǎn)周期長、易引起過敏,一旦流感爆發(fā)其來源將成為瓶頸,無法及時應(yīng)對流感疫情等問題。因此,開發(fā)新的人用流感疫苗生產(chǎn)介質(zhì)已成為疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵,WHO推薦細胞是生產(chǎn)疫苗的優(yōu)良介質(zhì)。采用細胞進行流感疫苗的發(fā)酵生產(chǎn),其質(zhì)量可控性好,封閉的生產(chǎn)體系方便安全,可以根據(jù)需求大批量發(fā)酵生產(chǎn),避免了由于流感大流行造成雞胚供應(yīng)不足而影響疫苗產(chǎn)量的缺點。目前,獲準生產(chǎn)人用流感疫苗的細胞系主要有Vero細胞和MDCK細胞。據(jù)報道,已有企業(yè)利用Vero細胞和MDCK細胞通過微載體系統(tǒng)進行發(fā)酵生產(chǎn)制備人用流感疫苗。Baxter公司已經(jīng)于2009年通過Vero細胞技術(shù)平臺生產(chǎn)了禽流感疫苗CELVAPAN并上市,Novartis公司于2007年用MDCK細胞生產(chǎn)了流感疫苗Optaflu并上市,同時Novartis公司于2009年又通過細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)了甲型H1N1流感疫苗。 采用細胞進行流感疫苗的制備,存在的主要問題是流感病毒產(chǎn)量低。人流感病毒主要通過結(jié)合到細胞表面的唾液酸寡糖上進行吸附感染,該唾液酸寡糖類型是N-乙酰唾液酸末端通過α2,6糖苷鍵連接到半乳糖上的(NeuAcα2,6 Gal)。雖然MDCK細胞和Vero細胞表面都有這種類型的唾液酸寡糖,但是豐度并不高。同時,細胞表面流感病毒受體的類型和數(shù)量存在著個體差異。另外,流感病毒在不同的細胞內(nèi)復(fù)制效率的高低也可能存在著個體化差異。所以可以通過篩選單克隆細胞株的方法來獲得流感病毒適應(yīng)性細胞。由于MDCK細胞對流感病毒的適應(yīng)性要好于Vero細胞,所以可以篩選MDCK單克隆細胞株來獲得對流感病毒高產(chǎn)的細胞株,以實現(xiàn)流感病毒在哺乳動物細胞中能夠高效復(fù)制擴增的目的。 為了實現(xiàn)利用細胞代替雞胚來生產(chǎn)制備流感疫苗的目的,我們篩選獲得能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細胞株和病毒株,進而優(yōu)化細胞和病毒培養(yǎng)條件,并進行大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗。我們通過兩方面進行篩選:第一,通過有限稀釋法制備單克隆細胞株,使用流感病毒進行感染,從而篩選出適應(yīng)流感病毒的單克隆細胞株;第二,篩選流感病毒株,用不同的流感病毒株感染單克隆MDCK細胞株,篩選出可以產(chǎn)生較高病毒滴度的流感病毒株。通過以上兩方面的篩選,獲得能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細胞株和病毒株,并進一步經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化,擴大培養(yǎng),為使用哺乳動物細胞進行大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗奠定基礎(chǔ),為流感爆發(fā),能夠及時大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗提供了技術(shù)保證,因此具有重大意義。 本課題的研究目的主要是通過有限稀釋法制備單克隆細胞株,篩選出適應(yīng)流感病毒高滴度復(fù)制的單克隆細胞株;用不同的流感病毒株感染單克隆細胞株,篩選出能產(chǎn)生較高病毒滴度的流感病毒株;將篩選獲得的單克隆細胞株和流感病毒株進行條件優(yōu)化,擴大培養(yǎng),從而制備流感疫苗,為細胞代替雞胚大規(guī)模生產(chǎn)制備流感疫苗奠定基礎(chǔ)。 本研究主要包括以下三個部分: 第一、甲型H1N1流感病毒株和MDCK單克隆細胞株的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化。通過有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞株,建立MDCK單克隆細胞庫。使用不同的甲型H1N1流感病毒株感染MDCK單克隆細胞株,通過血凝滴度檢測篩選出能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細胞株和病毒株。經(jīng)篩選后獲得能產(chǎn)生較高病毒滴度的細胞株和病毒株分別為M77單克隆細胞株和甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009。對篩選到的細胞株和病毒株進行TCID50滴度測定、空斑形成試驗、細胞表面NeuAcα2,6 Gal豐度測定、細胞株遺傳穩(wěn)定性等檢測。結(jié)果顯示,M77細胞株較普通MDCK細胞能顯著提高流感病毒滴度。將篩選到的細胞株建立MDCK細胞庫并進行細胞庫檢定,將篩選到的病毒株建立甲型H1N1流感病毒庫并進行病毒庫檢定,均符合要求。然后對病毒培養(yǎng)條件,包括細胞豐度、病毒稀釋液、病毒感染劑量(MOI)、培養(yǎng)溫度、病毒收獲時間等進行優(yōu)化。優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件為:接種病毒時細胞豐度選擇100%,采用無血清的DMEM培養(yǎng)基(含1μg/ml的TPCK-胰酶),MOI選擇0.001,培養(yǎng)溫度選擇37℃,病毒收獲時間選擇感染后72h～96h。以上條件優(yōu)化,為甲型H1N1流感病毒的擴大培養(yǎng)提供了技術(shù)保證。 第二、甲型H1N1流感病毒在MDCK細胞上的擴大培養(yǎng)、濃縮純化及檢測鑒定。將篩選到的甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009感染篩選到的MDCK單克隆細胞株M77,采用優(yōu)化了的較佳培養(yǎng)條件,依次在細胞培養(yǎng)瓶、細胞工廠和發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng),結(jié)果都較理想。將擴大培養(yǎng)收集的病毒收獲液通過1: 4000的甲醛滅活、10KD的膜包濃縮、30%與60%的蔗糖密度梯度離心純化、0.5%的Triton X-100裂解,并對純化前后的甲型H1N1病毒樣品進行電鏡觀察、血凝滴度、總蛋白含量、HA抗原含量、DNA殘留量等進行測定。結(jié)果顯示,經(jīng)MDCK細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒具典型流感病毒特征,純度達到98.3235%,雜蛋白去除率為98.30%,HA的回收率為40%,經(jīng)處理后DNA殘留量低于100 pg/劑。 第三、細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗的免疫效果評價。將由MDCK細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒進行純化后,制備成甲型H1N1流感裂解疫苗。將6周齡的雌性Balb/c小鼠隨機分組,每組12只,分為PBS對照組、雞胚來源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫組和細胞來源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫組。每只小鼠肌肉注射接種HA抗原15μg,注射量為200μl/只。第一次免疫后兩周進行第二次加強免疫。分別在一免一周、一免二周、二免一周和二免二周對小鼠進行尾靜脈采血,檢測其血清中抗體IgG,IgG1,IgG 2a以及IgG 2b的滴度和HI滴度,并且檢測其血清中細胞因子IL-4和IFN-γ的滴度以及小鼠脾臟淋巴細胞中分泌IL-4和IFN-γ的細胞頻數(shù)水平。用甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009和病毒株A/PR/8/34對二免二周的小鼠進行滴鼻攻毒實驗,評價細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗對小鼠的免疫保護性及交叉保護性。結(jié)果顯示,細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗與雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗都能激活較高的體液免疫水平,且細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗比雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗要更高。細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗和雞胚培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗對小鼠的免疫保護性都能達到100%。交叉保護性實驗顯示,細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感裂解疫苗比雞胚來源的流感裂解疫苗具有更好的交叉保護性。 結(jié)論:采用單克隆細胞株篩選的方法可以獲得能夠產(chǎn)生較高病毒滴度的細胞株,經(jīng)病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化后擴大培養(yǎng),可以獲得理想的病毒產(chǎn)量。經(jīng)動物實驗證實細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感疫苗具有很好的免疫效果、較高的免疫保護性及交叉保護性。為發(fā)展MDCK細胞規(guī)�；a(chǎn)流感疫苗奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1373546