本文關(guān)鍵詞：小鼠Myostatin基因表達載體的構(gòu)建及體外表達鑒定　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 隨著現(xiàn)代生活習(xí)慣的改變和生活質(zhì)量的提高,很多人開始胖起來,肥胖癥已漸漸成為危害全球人類健康的重要疾病,與2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、脂代謝異常、胰島素抵抗、非酒精性肝病、哮喘以及關(guān)節(jié)炎等等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的過度積聚是肥胖癥形成其中的中心環(huán)節(jié),多種因素參與過程其中,但是發(fā)病機制還不完全清楚,因此關(guān)于此方面的研究,對肥胖癥的防治有重要意義并逐漸成為熱門的課題。1997年美國基因?qū)W家發(fā)現(xiàn)肌肉生長抑素(Myostatin)及其基因(MSTN),對肌肉生長具有抑制作用,目前研究者普遍認(rèn)為肌肉是全身最大的耗能組織之一,肌肉生長抑素的缺乏可導(dǎo)致肌肉異常增生,同時可能出現(xiàn)肌肉耗能增加,從而調(diào)控能量的分配,對認(rèn)識肥胖的發(fā)病機制可能有重大的意義。本研究擬用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)及基因表達技術(shù),構(gòu)建該基因的表達載體,期待用于觀察MSTN基因過表達對肥胖小鼠體重、內(nèi)臟脂肪含量、糖脂代謝等的影響,進而進一步通過該工具觀察探討MSTN與肥胖癥的關(guān)系。 方法： 1小鼠MSTN蛋白表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mMSTN的構(gòu)建： 1.1mMSTN cDNA插入片段的擴增：從ICR小鼠肌肉組織中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR,獲得大量拷貝的MSTN cDNA,然后插入pEASY-T1克隆載體中,經(jīng)BamHI、ApaI雙酶切后,獲得帶有酶切位點的小鼠MSTN表達序列片段。 1.2載體片段的獲得：以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌,得到該質(zhì)粒的大量拷貝后,大量提取,經(jīng)BamH I、Apa I雙酶切后,進行瓊脂糖電泳回收,獲得用于構(gòu)建mMSTN表達質(zhì)粒的載體片段。 1.3應(yīng)用T4DNA連接酶,將帶有酶切位點的mMSTN擴增片段,與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒酶切以后的載體片段進行連接,構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-mMSTN質(zhì)粒。 2pcDNA3.1(-)-mZAG表達質(zhì)粒的體外鑒定：應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.1(+)-mMSTN質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中,48h后收集細(xì)胞提起RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,用real-time PCR方法觀察細(xì)胞中MSTN的表達情況。 結(jié)果： 1.成功克隆小鼠MSTN cDNA全序列,并將其與pcDNA3.1(+)載體片段連接,構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-mMSTN表達質(zhì)粒。 2.在體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系中,證實MSTN表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mMSTN可以在脂肪細(xì)胞中良好表達。 結(jié)論： 1成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-mMSTN表達質(zhì)粒,在體外能良好表達鼠源MSTN蛋白,是研究MSTN作用的一種有效工具。
[Abstract]:Objective: With the change of modern life habits and the improvement of quality of life, many people begin to gain weight. Obesity has gradually become an important disease that endangers the global human health, and type 2 diabetes mellitus, hypertension, cardiovascular and cerebrovascular diseases. Abnormal lipid metabolism, insulin resistance, non-alcoholic liver disease, asthma, arthritis and other diseases are closely related to the occurrence and development of many diseases. The excessive accumulation of lipid in adipocytes is the central link in the formation of obesity. A variety of factors participate in the process, but the pathogenesis is not completely clear, so the research on this aspect. In 1997, American geneticists discovered myostatin (Myostatin) and its gene (MSTN). At present, it is widely believed that muscle is one of the largest energy-consuming tissues in the whole body, and the deficiency of muscle somatostatin can lead to abnormal proliferation of muscle and increase of muscle energy consumption. The regulation of energy distribution may be of great significance in understanding the pathogenesis of obesity. This study intends to use plasmid construction technology and gene expression technology to construct the expression vector of the gene. It is expected to be used to observe the effects of MSTN gene overexpression on body weight, visceral fat content, glucose and lipid metabolism in obese mice, and to further explore the relationship between MSTN and obesity through this tool. Methods: 1 Construction of mouse MSTN protein expression plasmid pcDNA3.1 (mMSTN): Amplification of 1.1 mMSTN cDNA insert fragment: total RNAs were extracted from muscle tissues of ICR mice and a large number of copies of MSTN cDNA were obtained by RT-PCR. Then inserted into the pEASY-T1 clone vector and digested with BamHIHI-ApaI, the MSTN expression sequence of mice with restriction site was obtained. 1.2 the vector fragment was obtained: the plasmid pcDNA3.1 () was transformed into TOP10 receptive bacteria. After a large number of copies of the plasmid were obtained, a large number of copies were extracted and BamH I was used. After Apa I double enzyme digestion, agarose electrophoresis was used to recover the vector fragment used to construct mMSTN expression plasmid. 1.3 using T4 DNA ligase, the mMSTN fragment with restriction site was amplified and ligated with the vector fragment of pcDNA3.1 () plasmids. PcDNA3.1 (mMSTN) plasmid was constructed. In vitro identification of pcDNA3.1mZAG expression plasmid: cationic liposome transfection of pcDNA3.1 (). Mouse 3T3-L1 preadipocytes were transiently transfected with -mMSTN plasmid. After 48 hours, the cells were collected and cDNA was synthesized by reverse transcription. The expression of MSTN in the cells was observed by real-time PCR method. Results: 1. The whole mouse MSTN cDNA sequence was cloned and ligated with pcDNA3.1 () vector fragment to construct pcDNA3.1. MMSTN expression plasmid. 2. In the mouse 3T3-L1 preadipose cell line cultured in vitro, it was confirmed that the MSTN expression plasmid pcDNA3.1 (mMSTN) could be well expressed in adipocytes. Conclusion: 1. PcDNA3.1 (mMSTN) expression plasmid was successfully constructed, which can express murine MSTN protein well in vitro. It is an effective tool to study the role of MSTN.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R589.2;R3416

【共引文獻】

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6 ;Study on the Polymorphisms of Porcine Myostatin Gene in Promoter Region by PCR-RFLPS[J];Journal of Northeast Agricultural University(English Edition);2005年01期

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3 張嘉保;郭丹;曹陽;金海國;趙玉民;張國梁;;草原紅牛MSTN基因第一外顯子SNPs分析[A];第十次全國畜禽遺傳標(biāo)記研討會論文集[C];2006年

4 Y. L. Jiang;N. Li;G.Plastow;Z. L. Liu;X. X. Hu;C. X. Wu;;IDENTIFICATION OF THREE SNPs IN THE PORCINE MYOSTATIN GENE(MSTN)[A];第六屆動物遺傳學(xué)討論會論文集[C];2002年

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本文編號：1369563