本文關(guān)鍵詞：小鼠Myostatin基因表達(dá)載體的構(gòu)建及體外表達(dá)鑒定　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 肌肉生長(zhǎng)抑素 質(zhì)粒構(gòu)建 3T3-L1前脂肪細(xì)胞 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

【摘要】：目的： 隨著現(xiàn)代生活習(xí)慣的改變和生活質(zhì)量的提高,很多人開(kāi)始胖起來(lái),肥胖癥已漸漸成為危害全球人類健康的重要疾病,與2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、脂代謝異常、胰島素抵抗、非酒精性肝病、哮喘以及關(guān)節(jié)炎等等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的過(guò)度積聚是肥胖癥形成其中的中心環(huán)節(jié),多種因素參與過(guò)程其中,但是發(fā)病機(jī)制還不完全清楚,因此關(guān)于此方面的研究,對(duì)肥胖癥的防治有重要意義并逐漸成為熱門的課題。1997年美國(guó)基因?qū)W家發(fā)現(xiàn)肌肉生長(zhǎng)抑素(Myostatin)及其基因(MSTN),對(duì)肌肉生長(zhǎng)具有抑制作用,目前研究者普遍認(rèn)為肌肉是全身最大的耗能組織之一,肌肉生長(zhǎng)抑素的缺乏可導(dǎo)致肌肉異常增生,同時(shí)可能出現(xiàn)肌肉耗能增加,從而調(diào)控能量的分配,對(duì)認(rèn)識(shí)肥胖的發(fā)病機(jī)制可能有重大的意義。本研究擬用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)及基因表達(dá)技術(shù),構(gòu)建該基因的表達(dá)載體,期待用于觀察MSTN基因過(guò)表達(dá)對(duì)肥胖小鼠體重、內(nèi)臟脂肪含量、糖脂代謝等的影響,進(jìn)而進(jìn)一步通過(guò)該工具觀察探討MSTN與肥胖癥的關(guān)系。 方法： 1小鼠MSTN蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mMSTN的構(gòu)建： 1.1mMSTN cDNA插入片段的擴(kuò)增：從ICR小鼠肌肉組織中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR,獲得大量拷貝的MSTN cDNA,然后插入pEASY-T1克隆載體中,經(jīng)BamHI、ApaI雙酶切后,獲得帶有酶切位點(diǎn)的小鼠MSTN表達(dá)序列片段。 1.2載體片段的獲得：以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌,得到該質(zhì)粒的大量拷貝后,大量提取,經(jīng)BamH I、Apa I雙酶切后,進(jìn)行瓊脂糖電泳回收,獲得用于構(gòu)建mMSTN表達(dá)質(zhì)粒的載體片段。 1.3應(yīng)用T4DNA連接酶,將帶有酶切位點(diǎn)的mMSTN擴(kuò)增片段,與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒酶切以后的載體片段進(jìn)行連接,構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-mMSTN質(zhì)粒。 2pcDNA3.1(-)-mZAG表達(dá)質(zhì)粒的體外鑒定：應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.1(+)-mMSTN質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中,48h后收集細(xì)胞提起RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,用real-time PCR方法觀察細(xì)胞中MSTN的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.成功克隆小鼠MSTN cDNA全序列,并將其與pcDNA3.1(+)載體片段連接,構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-mMSTN表達(dá)質(zhì)粒。 2.在體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系中,證實(shí)MSTN表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mMSTN可以在脂肪細(xì)胞中良好表達(dá)。 結(jié)論： 1成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-mMSTN表達(dá)質(zhì)粒,在體外能良好表達(dá)鼠源MSTN蛋白,是研究MSTN作用的一種有效工具。
[Abstract]:Objective: With the change of modern life habits and the improvement of quality of life, many people begin to gain weight. Obesity has gradually become an important disease that endangers the global human health, and type 2 diabetes mellitus, hypertension, cardiovascular and cerebrovascular diseases. Abnormal lipid metabolism, insulin resistance, non-alcoholic liver disease, asthma, arthritis and other diseases are closely related to the occurrence and development of many diseases. The excessive accumulation of lipid in adipocytes is the central link in the formation of obesity. A variety of factors participate in the process, but the pathogenesis is not completely clear, so the research on this aspect. In 1997, American geneticists discovered myostatin (Myostatin) and its gene (MSTN). At present, it is widely believed that muscle is one of the largest energy-consuming tissues in the whole body, and the deficiency of muscle somatostatin can lead to abnormal proliferation of muscle and increase of muscle energy consumption. The regulation of energy distribution may be of great significance in understanding the pathogenesis of obesity. This study intends to use plasmid construction technology and gene expression technology to construct the expression vector of the gene. It is expected to be used to observe the effects of MSTN gene overexpression on body weight, visceral fat content, glucose and lipid metabolism in obese mice, and to further explore the relationship between MSTN and obesity through this tool. Methods: 1 Construction of mouse MSTN protein expression plasmid pcDNA3.1 (mMSTN): Amplification of 1.1 mMSTN cDNA insert fragment: total RNAs were extracted from muscle tissues of ICR mice and a large number of copies of MSTN cDNA were obtained by RT-PCR. Then inserted into the pEASY-T1 clone vector and digested with BamHIHI-ApaI, the MSTN expression sequence of mice with restriction site was obtained. 1.2 the vector fragment was obtained: the plasmid pcDNA3.1 () was transformed into TOP10 receptive bacteria. After a large number of copies of the plasmid were obtained, a large number of copies were extracted and BamH I was used. After Apa I double enzyme digestion, agarose electrophoresis was used to recover the vector fragment used to construct mMSTN expression plasmid. 1.3 using T4 DNA ligase, the mMSTN fragment with restriction site was amplified and ligated with the vector fragment of pcDNA3.1 () plasmids. PcDNA3.1 (mMSTN) plasmid was constructed. In vitro identification of pcDNA3.1mZAG expression plasmid: cationic liposome transfection of pcDNA3.1 (). Mouse 3T3-L1 preadipocytes were transiently transfected with -mMSTN plasmid. After 48 hours, the cells were collected and cDNA was synthesized by reverse transcription. The expression of MSTN in the cells was observed by real-time PCR method. Results: 1. The whole mouse MSTN cDNA sequence was cloned and ligated with pcDNA3.1 () vector fragment to construct pcDNA3.1. MMSTN expression plasmid. 2. In the mouse 3T3-L1 preadipose cell line cultured in vitro, it was confirmed that the MSTN expression plasmid pcDNA3.1 (mMSTN) could be well expressed in adipocytes. Conclusion: 1. PcDNA3.1 (mMSTN) expression plasmid was successfully constructed, which can express murine MSTN protein well in vitro. It is an effective tool to study the role of MSTN.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R589.2;R3416

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫維斌,陳宏,張琪;牛的雙肌(double-muscular)性狀研究進(jìn)展[J];黃牛雜志;2001年04期

2 史明艷,昝林森,朱貴明;雙肌牛的特征及其遺傳研究[J];黃牛雜志;2002年03期

3 黎仁軍;苗永旺;;牛肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的研究進(jìn)展[J];中國(guó)牛業(yè)科學(xué);2011年05期

4 金鑫燕;;山羊肌生成抑制素基因完全編碼序列分析[J];中國(guó)草食動(dòng)物;2011年02期

5 楊秀芹,劉娣,李景芬,孫繼權(quán);豬myostatin基因5’調(diào)控區(qū)的酶切多態(tài)性分析[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年03期

6 ;Study on the Polymorphisms of Porcine Myostatin Gene in Promoter Region by PCR-RFLPS[J];Journal of Northeast Agricultural University(English Edition);2005年01期

7 張宇光;許海濤;劉梅;胡蘭;;肌肉生成抑制素基因的研究[J];飼料工業(yè);2006年12期

8 石照應(yīng);主性;馮會(huì)利;曲月秀;陳蓉;田興貴;;貴州黑山羊肌肉生長(zhǎng)抑制素基因cDNA克隆及其蛋白抗原表位預(yù)測(cè)[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年05期

9 李楨,王寶維,柳楠;肌肉生長(zhǎng)抑制素基因—Myostatin的研究進(jìn)展[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年05期

10 李帥;楊舒黎;茍瀟;冷靜;毛華明;;肌肉生成抑制素(MSTN)基因研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2011年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前4條

1 陳代文;張克英;余冰;丁雪梅;;肌抑素對(duì)肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制[A];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展——中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第八屆全國(guó)代表大學(xué)暨第十屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

2 ;Genetic Variation Of Myostatin Promoter In Nanyang Cattle And Yak[A];第十次全國(guó)畜禽遺傳標(biāo)記研討會(huì)論文集[C];2006年

3 張嘉保;郭丹;曹陽(yáng);金海國(guó);趙玉民;張國(guó)梁;;草原紅牛MSTN基因第一外顯子SNPs分析[A];第十次全國(guó)畜禽遺傳標(biāo)記研討會(huì)論文集[C];2006年

4 Y. L. Jiang;N. Li;G.Plastow;Z. L. Liu;X. X. Hu;C. X. Wu;;IDENTIFICATION OF THREE SNPs IN THE PORCINE MYOSTATIN GENE(MSTN)[A];第六屆動(dòng)物遺傳學(xué)討論會(huì)論文集[C];2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張鶯鶯;中國(guó)主要牛種肌肉組織基因表達(dá)譜特征比較分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

2 矯繼峰;豬肌生成抑制素及其相關(guān)因子的表達(dá)分析[D];吉林大學(xué);2011年

3 馬喜山;豬骨骼肌發(fā)育相關(guān)基因的差異表達(dá)和多態(tài)性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

4 周玉長(zhǎng);Myostatin在早期胚胎骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)與可能功能[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

5 梁春年;牦牛MSTN和IGF-IR基因的克隆及SNPs與生長(zhǎng)性狀相關(guān)性研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

6 李慎濤;豬肌生成抑制素cDNA的克隆、表達(dá)及其組織器官表達(dá)譜的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué);2001年

7 顧志良;家禽Myostatin和OBR基因與骨骼肌和脂肪生長(zhǎng)發(fā)育性狀關(guān)系的遺傳學(xué)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

8 潘求真;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

9 李湘萍;綿羊體細(xì)胞myostatin基因敲除及定點(diǎn)整合mAAT基因的初步研究[D];廣西大學(xué);2002年

10 劉丑生;動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)調(diào)控因子基因和豬脂肪沉積調(diào)控基因的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉泳;肌肉生長(zhǎng)抑素原核表達(dá)條件優(yōu)化與表達(dá)產(chǎn)物鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 喬西波;家兔GH、GHR及MSTN基因多態(tài)性及其與產(chǎn)肉性狀的關(guān)系[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 劉東君;豬肌肉生長(zhǎng)抑制素基因啟動(dòng)子區(qū)不同單倍型遺傳效應(yīng)的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 盛鵬程;綿羊Myostatin基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 肖永久;以氦氧混合氣為驅(qū)動(dòng)氣源霧化吸入藥物治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的臨床研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

6 羅艷梅;山羊卵泡抑素（Follistatin）基因cDNA克隆、序列分析及組織表達(dá)研究[D];西南大學(xué);2011年

7 康峰;牛卵泡抑素基因和ω-3多不飽和脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及其檢測(cè)[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2011年

8 李婷;黑鯛MSTNⅡ基因分子特征[D];寧波大學(xué);2009年

9 閆永紅;天祝白牦牛肌生成抑制素基因序列分析及多態(tài)性研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

10 鄒曉龍;慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi特異性沉默豬Myostatin基因的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：1369563