本文關鍵詞：DFMG對LPC誘導HUVE-12細胞角蛋白18磷酸化的影響　出處：《湖南師范大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的： 觀察新型金雀異黃素(genistein, GEN)類似物7-二氟甲氧基-5,4’-二甲氧基金雀異黃素(7-difluoromethoxy-5,4'-dimethoxygenistein, DFMG)拮抗溶血性磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVE-12)凋亡是否涉及對角蛋白18磷酸化表達的調節(jié)。 方法： 體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮HUVE-12細胞,10μmol/L的LPC分別孵育細胞(6h、12h、24h和48h),探索并確定LPC誘導HUVE-12細胞凋亡模型所需的時間。分別用0.3、1.0、3.0μmol/L的DFMG預處理HUVE-12細胞30分鐘,再與LPC孵育24小時。然后用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞術分析細胞凋亡率,人細胞角蛋白18-M30定量檢測試劑盒檢測片段CK18的含量,western blotting方法檢測細胞角蛋白18、Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18的表達,免疫共沉淀驗證HUVE-12細胞K18/14-3-3復合物的表達。 結果： 1.10μmol/L LPC孵育人臍靜脈內皮細胞(HUVE-12)24h,增加CK18-M30的釋放,細胞培養(yǎng)液中CK18-M30的濃度達798.60±8.43mIU/ml,細胞凋亡率達30.98±2.04%,可作為后續(xù)實驗中LPC誘導HUVE-12細胞凋亡模型的最佳造模時間。 2.0.3、1.0、3.0μmol/L的DFMG使LPC誘導HUVE-12細胞CK18-M30釋放減少(P0.001),其細胞培養(yǎng)液的CK18-M30濃度分別是701.00±2.65mIU/ml,599.77±2.30mIU/ml,402.47±4.16mIU/ml,與10μmol/LLPC模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001),且作用呈濃度-效應依賴性；較相同濃度GEN組(753.90±5.07mIU/ml,700.97±3.60mIU/ml,548.83±3.98mIU/m1)減少CK18-M30的釋放作用更強(P0.05)。 3.0.3、1.0、3.0μmol/L的DFMG分別使LPC誘導HUVE-12細胞凋亡率下降到27.50±2.06%,23.52±2.59%,13.70±2.00%,與10μmol/LLPC模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001),且作用強于相同濃度GEN組(29.42±2.09%,27.57±0.76%,24.29±2.49%)(P0.05)。 4. western blotting結果顯不：與正常對照組相比,10μmol/LLPC便HUVE-12細胞Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18表達上調,使未磷酸化角蛋白18表達下調,DFMG和GEN可呈濃度依賴性地拈抗LPC誘導的HUVE-12細胞Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18表達,相同濃度的DFMG作用強于GEN。 5.免疫共沉淀結果顯示：在提取的HUVE-12細胞總蛋白中,在14-3-3抗體免疫沉淀下來的蛋白復合物中可以檢測到CK18,同時在CK18抗體免疫沉淀下來的蛋白復合物中也可以檢測到14-3-3蛋白,說明CK18與14-3-3蛋白在HUVE-12細胞中存在相互作用。與正常對照組相比,10μmol/LLPC模型組14-3-3蛋白與CK18共沉淀增強。DFMG和GEN均能降低LPC誘導的HUVE-12細胞中14-3-3蛋白與CK18的結合水平,DFMG的這種作用強于GEN。 結論： DFMG拮抗LPC誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVE-12)凋亡與其阻斷角蛋白18磷酸化表達相關。
[Abstract]:Objective:
The observation model of genistein (genistein, GEN) analogs of 7- two fluorine methoxy -5,4 '- methoxy two fund genistein (7-difluoromethoxy-5,4'-dimethoxygenistein, DFMG) antagonist lysophosphatidylcholine (lysophosphatidylcholine, LPC) induced human umbilical vein endothelial cells (HUVE-12) apoptosis is involved in regulation of the expression of phosphorylation of keratin 18.
Method錛，

本文編號：1364292