本文關(guān)鍵詞：人星狀病毒1型衣殼蛋白的序列分析、克隆表達(dá)及多克隆抗體制備　出處：《東華大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：人星狀病毒(Human astrovirus, HAstV)是引起急性病毒性胃腸炎的常見致病原因之一。其包括8個(gè)血清型即人星狀病毒1型至8型,但以人星狀病毒1型(Human astrovirus serotype 1, HAstV-1)在世界范圍內(nèi)最為流行。HAstV-1的基因組長(zhǎng)度約6.8 kb,是無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒,包括三個(gè)開放讀碼框架ORF1a、ORF1b、ORF2。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示,由ORF2編碼的衣殼蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一-VP26片段,可能在病毒與細(xì)胞間相互作用過(guò)程中必不可少,而且該片段可能還包含中和及免疫反應(yīng)表位。 本研究首先對(duì)11株來(lái)自不同地區(qū)HAstV-1的衣殼蛋白前體基因核苷酸、氨基酸序列進(jìn)行同源性比較并繪制進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)按地區(qū)差異可分為兩個(gè)基因組；再利用若干生物學(xué)分析軟件分析VP26片段的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性和抗原特征。然后利用原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中克隆、表達(dá)重組VP26蛋白并以NTA-Ni2+親和層析法純化重組蛋白,運(yùn)用SDS-PAGE電泳、BCA試驗(yàn)、Western blot等方法對(duì)重組蛋白純度、濃度、抗原性進(jìn)行評(píng)價(jià)鑒定。以重組VP26蛋白作為抗原,免疫新西蘭大耳兔獲得多抗血清并對(duì)其效價(jià)、特異性用ELISA方法鑒定。 結(jié)果表明：(1)原核表達(dá)載體pET30a(+)-VP26構(gòu)建成功,重組VP26蛋白可在大腸桿菌Rosetta 2宿主菌中大量表達(dá)。(2)該重組VP26蛋白是研究VP26片段抗原性、生化特性、結(jié)構(gòu)功能的理想工具,可用于評(píng)價(jià)該片段在免疫診斷和疫苗研制中的作用。(3)該原核表達(dá)、親和層析純化系統(tǒng)可用于滿足今后大規(guī)模疫苗制備和檢測(cè)試劑盒開發(fā)的需求,尤其是在應(yīng)用于檢測(cè)抗體的ELISA試劑盒包被抗原時(shí),結(jié)果和成本要優(yōu)于使用全病毒。(4)免疫兔所得多抗血清效價(jià)達(dá)到1：8000可以滿足夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)的需要。 綜上所述,HAstV-1衣殼蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)建立和多克隆抗體制備可以作為今后相關(guān)研究的基礎(chǔ),有助于對(duì)HAstV-1感染致病機(jī)理、免疫診斷和疫苗研制的更深入研究。
[Abstract]:Human stellate virus astrovirus. HAstV is one of the common causes of acute viral gastroenteritis, including eight serotypes, human stellate virus type 1 to 8. However, human astrovirus serotype 1 was isolated from human stellate virus type 1. HAstV-1) the genome length of HAstV-1, which is the most popular in the world, is about 6.8 kb and is a single-stranded positive strand RNA virus without capsule. The bioinformatics prediction showed that one of the main structural proteins of capsid protein encoded by ORF2 was VP26 fragment. It may be necessary in the process of virus-cell interaction, and the fragment may also contain neutralized and immunoreactive epitopes. In this study, 11 strains of capsid protein precursor genes from different regions of HAstV-1 were compared in nucleotide and amino acid sequence homology and the phylogenetic tree was drawn. It was found that two genomes could be divided into two genomes according to regional differences. The physicochemical properties, structure, biological characteristics and antigen characteristics of VP26 fragments were analyzed by several biological analysis softwares, and then cloned in E. coli by prokaryotic expression system. The recombinant VP26 protein was expressed and purified by NTA-Ni2 affinity chromatography. The recombinant protein was purified by SDS-PAGE electrophoresis. Western blot was used to evaluate the purity, concentration and antigenicity of the recombinant protein. The recombinant VP26 protein was used as antigen to immunize New Zealand rabbits to obtain the polyclonal antiserum and its titer. The specificity was identified by ELISA. The results showed that the prokaryotic expression vector pET30a (pET-VP26) was successfully constructed. Recombinant VP26 protein can be expressed in Escherichia coli Rosetta 2 host strain. (2) the recombinant VP26 protein is used to study the antigenicity and biochemical characteristics of VP26 fragment. An ideal structural and functional tool for evaluating the role of the fragment in immunological diagnosis and vaccine development. Affinity chromatography purification system can be used to meet the needs of large-scale vaccine preparation and detection kit development in the future, especially when used in the detection of antibody ELISA kit coated antigen. The results and cost were better than that of the whole virus. 4) the titer of the polyantiserum was 1: 8000, which could meet the needs of the sandwich ELISA test. To sum up, the establishment of prokaryotic expression system of HAstV-1 capsid protein and the preparation of polyclonal antibody can be used as the basis of related research in the future, which is helpful to the pathogenesis of HAstV-1 infection. Further research on immune diagnosis and vaccine development.
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1361537