本文關(guān)鍵詞：空腸彎曲菌血紅素氧合酶ChuZ的結(jié)構(gòu)解析與功能研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni, C. jejuni)是一種重要的食源性感染病原菌。全球范圍內(nèi),空腸彎曲菌感染是急性胃腸炎最常見的病因之一,其嚴(yán)重的并發(fā)癥為Guillain-Barré和Miller-Fischer綜合癥。隨著日益嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn),C. jejuni感染的控制和治療受到嚴(yán)峻的考驗,迫切需要尋找新的途徑來控制這類致病菌的感染。鐵對于細(xì)菌的生長是至關(guān)重要的,盡管地球上有著非常豐富的鐵元素,但是對于致病菌來說鐵的生物利用度卻相當(dāng)?shù)�。對C. jejuni來說,來自宿主紅細(xì)胞裂解的血紅蛋白血紅素(heme)是其鐵的主要來源。而血紅素氧合酶ChuZ在降解血紅素并獲取鐵的機(jī)制中起到非常重要的作用。本研究擬解析ChuZ的晶體結(jié)構(gòu),從分子水平闡明C. jejuni利用鐵元素的機(jī)制,從而為以ChuZ為靶點,通過阻斷C. jejuni對鐵元素的攝取,開發(fā)抗C. jejuni感染的的新型藥物提供理論依據(jù)。 方法: 1.chuZ基因克隆及重組ChuZ蛋白的制備。 以C. jejuni(NCTC11168)全基因組為模板,PCR擴(kuò)增chuZ基因并構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET22b上,采用E. coli BL21工程菌表達(dá)ChuZ蛋白。依次采用親和層析、分子篩層析和離子交換層析方法純化得到高質(zhì)量的ChuZ蛋白。 2.ChuZ結(jié)晶條件搜索。 采用Hampton Research公司的72孔板(HR3-086)和晶體初篩試劑盒Index、crystal screen HR110、SaltRx和PEG/ion等,通過Mircobatch法進(jìn)行初步的結(jié)晶條件篩選,在得到初步結(jié)晶條件的基礎(chǔ)上,對結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化獲得最終的結(jié)晶條件。 3.晶體數(shù)據(jù)收集處理和結(jié)構(gòu)解析。 X-射線晶體衍射方法收集到ChuZ-hemin的衍射數(shù)據(jù),采用分子置換法以已有結(jié)構(gòu)(3GAS)為模型獲得相位并解析得到ChuZ-hemin復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),并對最終模型進(jìn)行分析。 4.酶活相關(guān)關(guān)鍵殘基功能分析。 在結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,制備參與結(jié)合底物血紅素的相關(guān)殘基突變體,對參與結(jié)合底物血紅素的相關(guān)殘基進(jìn)行突變,檢測突變體的酶學(xué)活性并與野生型ChuZ活性相比較,驗證和評價ChuZ酶活的關(guān)鍵殘基。 5.表面獨特的血紅素結(jié)合位點的分析。 分別用紫外分光光度法和ITC法測量ChuZ蛋白及其突變體與血紅素的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合比例。 6.突變體晶體結(jié)構(gòu)分析。 制備參與結(jié)合底物血紅素的相關(guān)殘基突變體蛋白,結(jié)合hemin后采用制備ChuZ晶體同樣方法、收集衍射數(shù)據(jù)并解析突變體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了表達(dá)ChuZ蛋白的重組質(zhì)粒pET22b-chuZ,并實現(xiàn)了其以可溶形式表達(dá)。經(jīng)多種層析方法的聯(lián)合應(yīng)用后,純化得到了高純度的ChuZ蛋白,蛋白純度達(dá)到95%以上。 2.以出現(xiàn)針狀晶體條件優(yōu)化,最終晶體生長條件為:蛋白濃度168mg/ml,microbatch板生長,池液條件:0.1M MES 23%PEG400 50mM pH6.5 iminazole 50mM ammonium tartrate ,蛋白與池液1:1混合放置3天后即出現(xiàn)紅色棍狀晶體,七天后晶體大小為0.1×0.1×0.7 mm3。 3.運用X-射線晶體衍射法收集了一套2.4?分辨率的ChuZ-hemin數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)處理結(jié)果:空間群C2221,晶胞參數(shù)a = 106.474, b = 106.698,c = 52.464 ?,α=β=γ=90°。運用PHASER程序以HugZ(PDB ID 3GAS)為模型,采用分子置換法解析了ChuZ的三維結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)采用split-barrel折疊方式,明顯不同于經(jīng)典的全α螺旋的單體血紅素氧合酶的結(jié)構(gòu)。明確了參與底物結(jié)合的關(guān)鍵殘基如R166、H9和H14。 4.成功構(gòu)建了R166A、H245Q/R166A、H245Q/H9A/H14A、R166A/H9A/H14A、H9A/H14A突變體,通過酶活實驗明確了R166A/H9A/H14A完全喪失了酶的活性。 5.紫外吸光度值測定結(jié)果表明:H9A/H14A的ChuZ突變體結(jié)合一個hemin,野生型ChuZ結(jié)合1.5個hemin。ITC結(jié)果表明H9A/H14A突變體和wild-type ChuZ的結(jié)合常數(shù)與其它細(xì)菌的HO基本一致,結(jié)合比例與紫外結(jié)果和晶體結(jié)構(gòu)中一致。 6.獲得了H9A/H14A突變體的晶體,并收集得到一套3?的數(shù)據(jù),電子密度圖顯示,其表面血紅素結(jié)合位點沒有血紅素的殘余密度,提示該突變體喪失了結(jié)合血紅素的能力。 結(jié)論: ChuZ的三維結(jié)構(gòu)采取獨特的split-barrel折疊方式,與大多數(shù)獲得結(jié)構(gòu)解析的全α螺旋的單體血紅素氧合酶的結(jié)構(gòu)明顯不同,屬于一個以HugZ為代表的新的血紅素氧合酶家族。ChuZ在溶液和晶體中以同源二聚體存在。在ChuZ的精細(xì)結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一個新的血紅素結(jié)合位點,它與普遍存在于血紅素蛋白中的“經(jīng)典位點”不同,位于分子表面通過水分子介導(dǎo)的四個組氨酸結(jié)合血紅素,這樣的結(jié)合方式在其他血紅素氧合酶中尚未發(fā)現(xiàn)過。定點突變研究證實了ChuZ是新一類血紅素結(jié)合蛋白家族的特殊成員,并通過對ChuZ的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系分析以及與同源蛋白的對比研究,發(fā)現(xiàn)C端結(jié)構(gòu)域的血紅素結(jié)合“口袋”是ChuZ酶催化機(jī)制的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Campylobacter jejuni (Campylobacter jejuni, C. jejuni) is an important foodborne pathogens. Worldwide, Campylobacter infection is one of the most common cause of acute gastroenteritis, the serious complication for Guillain-Barr and Miller-Fischer syndrome. With the emergence of multi drug resistance is becoming increasingly serious, control and treatment of C. jejuni infection the challenge, the urgent need to control this kind of pathogen infection find new ways. Iron is essential for bacterial growth, although there are very rich in iron, but for pathogenic bacteria, iron bioavailability is very low. For C. jejuni, from the host red cell lysis of hemoglobin heme (heme) is the main source of iron. Play very important role to the mechanism of heme oxygenase ChuZ in the degradation of heme iron and get in The purpose of this study is to analyze the crystal structure of ChuZ, and elucidate the mechanism of C. jejuni utilizing iron from molecular level, so as to provide theoretical basis for developing ChuZ targeted drugs against C. jejuni by blocking the uptake of iron and C. by C. jejuni.
Method:
Cloning of 1.chuZ gene and preparation of recombinant ChuZ protein.
C. jejuni (NCTC11168) genome as template, PCR amplification of chuZ gene and construct the prokaryotic expression vector pET22b. The expression of ChuZ protein by E. coli BL21. In engineering bacteria by affinity chromatography, molecular sieve chromatography and ion exchange chromatography purification method to get high quality ChuZ protein.
2.ChuZ crystallizing condition search.
By using the 72 hole plate Hampton Research company (HR3-086) and crystal screening kit for Index crystal, screen HR110, SaltRx and PEG/ion, were screened preliminary crystallization conditions by Mircobatch method, based on the initial crystallization conditions on the crystallization conditions were optimized to obtain the final crystallization conditions.
3. crystal data collection processing and structural analysis.
The diffraction data of ChuZ-hemin were collected from the X- ray diffraction method. The phase structure of 3GAS was obtained by molecular replacement method. The crystal structure of ChuZ-hemin complex was analyzed and the final model was analyzed.
Analysis of the function of key residues in 4. enzyme activities.
On the basis of structural analysis, preparation of related residues involved in binding mutant substrate heme, the residues involved in binding the substrate heme mutation, enzyme activity was detected and compared with wild-type ChuZ activity, ChuZ enzyme activity test and evaluate the key residues.
5. analysis of the unique surface of the heme binding site.
The binding constants and binding ratios of ChuZ protein and its mutants to heme were measured by UV spectrophotometry and ITC respectively.
Analysis of the crystal structure of 6. mutant.
We prepared the mutant residues related to hemoglobin in combination with hemin. After the combination of ChuZ, we collected the diffraction data and analyzed the crystal structure of the mutant protein by the same method.
Result:
1., a recombinant plasmid pET22b-chuZ expressing ChuZ protein was successfully constructed and expressed in a soluble form. After being combined with various chromatography methods, a high purity ChuZ protein was obtained and the purity of the protein reached over 95%.
2. to optimize the crystal conditions of acicular crystal growth, the final condition is: the concentration of protein 168mg/ml, microbatch in growth conditions: 0.1M MES liquid pool 23%PEG400 50mM pH6.5 iminazole 50mM ammonium tartrate, protein and 1:1 mixed liquid pool after 3 days that the red stick like crystal, seven days after the crystal size is 0.1 x 0.1 x 0.7 mm3.
3. using X- ray diffraction method to collect a set of 2.4? ChuZ-hemin data resolution, the results of data processing: C2221 space group, unit cell parameters a = 106.474, B = 106.698, C = 52.464, alpha beta gamma = =? =90 degrees. Using the PHASER program with HugZ (PDB ID 3GAS) as a model, using molecular replacement method analysis of the 3D structure of ChuZ, the structure of the Split-Barrel folding pattern, structure of monomer heme is significantly different from the classical alpha helix synthase. The key residues involved in substrate binding, such as R166, H9 and H14.
4., R166A, H245Q/R166A, H245Q/H9A/H14A, R166A/H9A/H14A and H9A/H14A mutants were successfully constructed, and R166A/H9A/H14A activity was completely lost by enzyme activity experiments.
5. UV absorbance measurement results show that the ChuZ mutant H9A/H14A with a hemin, wild type ChuZ combined with 1.5 hemin.ITC results showed that the binding constants of H9A/H14A mutant and wild-type ChuZ and other bacteria HO consistent with the proportion of UV and the crystal structure.
6., we obtained the crystal of H9A/H14A mutant and collected a set of 3? Data. Electron density map showed that there was no residual density of heme on the surface of heme binding site, suggesting that the mutant lost the ability to bind heme.
Conclusion:
The three-dimensional structure of ChuZ Split-Barrel by folding the unique way, structure of the monomer heme and obtain the most alpha helix analytical synthase is obviously different, belong to a to HugZ as the representative of the new family of heme oxygenase.ChuZ in solution and in the crystal as Homo dimer has two fine structure in ChuZ. The discovery of a new heme binding site, and it exists in the heme protein in "classic sites", four histidine on the surface of the enzyme by water molecule mediated binding to the heme binding mode, like in other heme oxygenase has not been found. The study demonstrated that ChuZ is a new kind of the heme binding protein family members special mutagenesis, and through the analysis of the relationship between structure and function of ChuZ and homologous protein comparative study, found that heme C domain binding pocket "" is the key structural basis of the ChuZ enzyme catalysis mechanism.

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：1360464