本文關鍵詞：TNF-α通過α7nACHR調節(jié)內皮祖細胞功能　出處：《第二軍醫(yī)大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，是一種能直接分化為血管內皮細胞的前體細胞，不僅參與人胚胎血管生成，而且也參與出生后的血管新生及血管內皮損傷后的修復過程。在炎癥反應中，內皮細胞不僅是參與者，還是首先受損的靶細胞，進而造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，這可能是器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。大量的動物和臨床試驗已經(jīng)證明：創(chuàng)傷時，循環(huán)及組織中的EPCs動員、增殖，并分化為內皮細胞修復損傷的血管內皮細胞，從而改善微循環(huán)，增加器官供血；而如果創(chuàng)傷嚴重，發(fā)生EPCs的調節(jié)失代償，則會導致微循環(huán)的損傷無法修復，進一步加重器官損害，直至功能衰竭，發(fā)生MODS。 近年來，臨床上通過內皮祖細胞移植治療心腦血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷等缺血性疾病取得了重要成功，顯示了廣闊的應用前景。但是從在臨床應用上也存在一定的限制：一是培養(yǎng)數(shù)量有限，不能滿足臨床治療需要；二是培養(yǎng)時間較長，容易導致延誤最佳的治療時間。 煙堿樣乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors, nAChR)α-7亞型屬于配體門控型離子通道受體，，是迷走神經(jīng)激活的“膽堿能抗炎通路”的一個重要成分，機體能通過膽堿能抗炎通路調節(jié)炎癥過程中腫瘤壞死因子（TNF）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和其他細胞因子的水平。研究發(fā)現(xiàn)，在血管內皮祖細胞表面表達α7nACHR，且對EPCs的功能調節(jié)發(fā)揮重要作用。 本研究通過對乙酰膽堿煙堿樣受體的干預觀察腫瘤壞死因子（TNF-α）對EPCs調節(jié)作用的變化，研究闡明TNF-α通過α7nACHR發(fā)揮對EPCs的調節(jié)作用。為各種炎癥、創(chuàng)傷等引起的MODS的臨床預防、早期治療、甚至逆轉MODS病情進展提供理論依據(jù)。 本研究分為兩部分，首先從臍靜脈血分離培養(yǎng)內皮祖細胞，并進行鑒定及檢測其增殖、遷移及成血管能力等；其次觀察TNF-α對EPCs的調節(jié)作用受α7nACHR的激動劑及抑制劑的影響，探討腫瘤壞死因子對內皮祖細胞的調節(jié)機制。全文共分兩個部分： 第一部分臍靜脈血內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：從臍靜脈血分離培養(yǎng)內皮祖細胞，為下一步研究打好實驗基礎。 方法：用密度梯度離心法從臍靜脈血中分離出單個核細胞，按照1×10~6/cm~2的密度接種于培養(yǎng)皿內，使用添加了細胞因子和胎牛血清的內皮祖細胞專用培養(yǎng)液進行誘導分化培養(yǎng)，在固定時間進行消化、傳代和擴增。通過細胞形態(tài)學特征、細胞的超微結構、免疫組化、流式細胞儀技術、乙�；牡兔芏戎鞍祝―il-Ac-LDL)和FITC標記的荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1）的吞噬功能、體外血管生成功能等方法對其進行鑒定為正在分化的EPCs。Werstern Blot（蛋白免疫印跡法）檢測內皮祖細胞表達α7nACHR。 結果：培養(yǎng)2天后逐漸出現(xiàn)梭形貼壁細胞（attaching cells, AT cells)，第5天逐漸出現(xiàn)貼壁細胞聚集形成集落，到7-9天，貼壁細胞可鋪滿培養(yǎng)皿底。P4代EPCs電鏡觀察可見：細胞內可檢測到典型的Weibel-Palade小體。超過80%體外培養(yǎng)的貼壁細胞都特異性地攝取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。免疫組化結果顯示：CD133（+）、CD34（++）、CD31（+++）、KDR（+++），CD133（+）、CD34（++）、CD31（+++）、KDR（+++）。流式細胞儀技術鑒定：CD133的陽性率：19.14±4.06%，CD34的陽性率：45.08±6.15%，CD31的陽性率：79.62±11.24%，KDR的陽性率：85.32±12.09%。體外血管生成功能：22.92±8.62個/HP。粘附功能：貼壁率為53.04±4.80%。遷徙功能：遷徙率為14.41±1.65%。增殖功能：7天增殖細胞數(shù)是19.16±3.66×104。 結論：以臍靜脈血為來源可以分離培養(yǎng)出的內皮祖細胞數(shù)量穩(wěn)定，具有典型內皮祖細胞形態(tài)特點及各種功能，表面表達α7nACHR，為下一步的研究提供技術支持。 第二部分：TNF-α通過α7nACHR調節(jié)內皮祖細胞功能的研究 目的：旨在探討炎癥介質對EPCs調節(jié)途經(jīng)是通過煙堿樣乙酰膽堿受體，為臨床應用相關疾病提供理論依據(jù)。 方法：實驗選取10個培養(yǎng)皿，均加入TNF-α(100mg/L)，隨機選取其中5個作為A組，依次加入尼古丁（0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L），標為A1-5；其余5個分為B組，依次加入甲基牛扁亭堿（0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L），標為B1-5。分別培養(yǎng)T1-3（12h、24h、48h）后行流式細胞儀檢測、 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1攝取實驗、體外血管生成實驗、EPCs增殖功能、粘附功能及遷徙功能檢測。 結果：流式細胞術檢測（陽性率）：A1-A5：CD133：18.67±4.06%，CD34：47.08±7.08%，CD31：82.16±8.89%，KDR：89.02±8.28%；B1-B5：CD133：16.19±6.04%，CD34：48.12±6.34%，CD31：80.43±9.01%，KDR：87.24±9.12%。體外血管生成功能：A1-A5：20.02±4.67個/HP；B1-B5：10.38±7.55個/HP。粘附功能（貼壁率）：A1-A5：48.14±5.78%；B1-B5：29.08±5.12%。遷徙功能（遷徙率）：A1-A5：12.82±1.44%；B1-B5：4.87±0.82%。增殖功能：培養(yǎng)7天增殖細胞數(shù)：A1-A5：18.87±4.45×10~4；B1-B5：4.12±1.02×10~4。 結論：TNF-α可降低EPCs的增殖、遷移、黏附和體外血管形成能力，且受膽堿 小結：機體在炎癥、創(chuàng)傷等過程中，體內EPCs的數(shù)量減少及功能障礙可能是導致MODS發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。TNF-α作為重要的炎癥因子在此過程中起到不可或缺的作用。而TNF-α對EPCs數(shù)量及功能的調節(jié)，煙堿樣乙酰膽堿能通路可能是一條重要途徑。因此在炎癥創(chuàng)傷早期，通過對α7nACHR的干預，可阻斷炎癥因子對EPCs的破壞，從而為MODS的早期防治、臨床治療，甚至防止MODS的發(fā)生提供可能的治療方法。
[Abstract]:Endothelial progenitor cells (endothelial progenitor, cells, EPCs) is a kind of can directly differentiate into vascular endothelial precursor cells, not only involved in human embryonic angiogenesis, but also participate in the repair process of angiogenesis and vascular endothelial injury after birth. After in inflammation, endothelial cells are not only the target participants. Cells are first damaged, causing the microvascular injury, microcirculation, which may be the earliest part of MODS. A large number of animal and clinical trials have proved that the trauma, circulation and tissue EPCs mobilization, proliferation, and differentiation of endothelial cells to repair damaged endothelial cells, improve microcirculation, increase if the organ blood supply; severe trauma, EPCs regulation will lead to decompensation, microcirculation damage can not be repaired, further aggravate organ damage, until failure occurred, MODS.
In recent years, the clinical through endothelial progenitor cell transplantation in the treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases, tumor angiogenesis and wound ischemic disease has achieved important success, shows a wide application prospect in clinical application. But from there are certain limitations: one is to develop a limited number, can not meet the needs of clinical treatment; two is to train a long time, easily lead to delay the best treatment time.
Nicotinic acetylcholine receptors (nicotinic, acetylcholine receptors, nAChR -7) alpha subtype belongs to the ligand gated ion channel receptor, activation of the cholinergic vagus nerve is an important component of anti-inflammatory pathway, the body through the cholinergic anti-inflammatory pathway of tumor necrosis factor in the regulation of the inflammatory process (TNF), high mobility group protein B1 (HMGB1) and other cytokines. The study found that the expression of alpha 7nACHR in the surface of vascular endothelial progenitor cells, and the function of EPCs regulation play an important role.
The effects of tumor necrosis factor by acetylcholine nicotinic receptor intervention (TNF- alpha) change regulation of EPCs, shows that TNF- alpha plays an important role in regulating EPCs by alpha 7nACHR. For a variety of inflammation, early treatment of MODS clinical prevention, trauma, or even reverse the progression of MODS and provide a theoretical basis.
This study is divided into two parts, first isolated and cultured endothelial progenitor cells from umbilical vein blood, and identify and detect the proliferation, migration and angiogenesis ability; secondly effects regulated by TNF- alpha EPCs alpha 7nACHR by agonists and inhibitors, to explore the mechanism of tumor necrosis factor on endothelial progenitor cells this paper is divided into two parts:
The first part of the separation of endothelial progenitor cells, culture and identification
Objective: to isolate and culture endothelial progenitor cells from umbilical vein blood, and to lay a good foundation for the next study.
Methods: isolated by density gradient centrifugation from umbilical cord blood mononuclear cells, according to 1 * 10~6/cm~2 were inoculated in culture dishes, supplemented with endothelial progenitor cells in special culture medium and fetal bovine serum cytokines to induce the differentiation of cultured by digestion in a fixed time, and amplified by cell passage. The morphological characteristics, cell ultrastructure, immunohistochemistry, flow cytometry, acetylated low density lipoprotein (Dil-Ac-LDL) and FITC -1 labeled Ulex europaeus agglutinin (FITC-UEA-1) phagocytosis, in vitro angiogenesis function method for its identification for differentiating EPCs.Werstern Blot (Western blot) detection of endothelial progenitor cells expressing alpha 7nACHR.
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本文編號：1359310