發(fā)布時(shí)間：2017-12-30 08:22

  本文關(guān)鍵詞：miR-148a通過DNMT1調(diào)控MSCs向心肌分化的內(nèi)在作用機(jī)制研究　出處：《中國免疫學(xué)雜志》2017年04期 　論文類型：期刊論文

  更多相關(guān)文章： miR-a DNMT 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 向心肌分化

【摘要】：目的:驗(yàn)證DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)是miR-148a直接調(diào)控的靶基因,探究miR-148a通過靶向DNMT1調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向心肌分化的作用機(jī)制。方法:MSCs細(xì)胞經(jīng)5'-氮胞苷(5'-aza)誘導(dǎo)向心肌分化后,使用miRNA芯片篩選出誘導(dǎo)前后表達(dá)差異的miRNAs。Targetscan軟件分析異常表達(dá)的miR-148a的靶基因,將野生型或突變型DNMT1的3'-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告基因的下游(DNMT1-wt或DNMT1-mut)并分別與miR-148a mimics(miR-148a模擬物)或scramble(miR-148a陰性對(duì)照)共轉(zhuǎn)染,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證所預(yù)測(cè)的靶基因DNMT1,qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-638 mimics和scramble后,對(duì)DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建miR-148a慢病毒質(zhì)粒,分別在轉(zhuǎn)染到MSCs后的第1、7、14和28天后檢測(cè)miR-148a對(duì)GATA結(jié)合因子4(Gata-4)基因上游DNA調(diào)控序列CpG甲基化水平的影響、qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-148a慢病毒質(zhì)粒后對(duì)心肌特異蛋白:球蛋白重鏈(MHC)和心臟肌鈣蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表達(dá)的影響,以及對(duì)心肌特異轉(zhuǎn)錄因子心臟特異性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表達(dá)的影響。結(jié)果:miRNA芯片篩選5'-aza誘導(dǎo)MSCs向心肌分化后表達(dá)異常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表達(dá)明顯上調(diào)。Targetscan、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和qRT-PCR驗(yàn)證DNMT1是miR-148a直接調(diào)控的靶基因。miR-148a慢病毒感染MSCs細(xì)胞,證實(shí)在轉(zhuǎn)染的不同時(shí)間,Gata-4上游基因甲基化水平發(fā)生改變,且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長,Gata-4甲基化水平呈不斷降低趨勢(shì),MSCs細(xì)胞內(nèi)MHC和c Tn T表達(dá)提高,CD90和CD29表達(dá)降低,Nkx2.5和Gata-4表達(dá)提高,MSCs細(xì)胞出現(xiàn)向心肌分化。結(jié)論:miR-148a可通過靶向調(diào)控DNMT1而調(diào)控MSCs細(xì)胞的向心肌分化。
[Abstract]:......
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院兒科;
【基金】：2015年重慶市第八批應(yīng)用技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.cstc2015jcyjA 10042) 2015年重慶市永川區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.Ycstc,2015nc5003)
【分類號(hào)】：R329.2
【正文快照】： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,2000和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司。蛋白MSCs)是存在于骨髓中的干細(xì)胞,不同誘導(dǎo)條件下,提取試劑盒、ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA蛋白MSCs可分化為中胚層或外胚層組織細(xì)胞,如成骨細(xì)定量檢測(cè)試劑盒均購于美國Thermo公司�；蚪M

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本文編號(hào)：1354095