本文關鍵詞：miR-148a通過DNMT1調控MSCs向心肌分化的內在作用機制研究　出處：《中國免疫學雜志》2017年04期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的:驗證DNA甲基轉移酶1(DNMT1)是miR-148a直接調控的靶基因,探究miR-148a通過靶向DNMT1調控骨髓間充質干細胞(MSCs)向心肌分化的作用機制。方法:MSCs細胞經5'-氮胞苷(5'-aza)誘導向心肌分化后,使用miRNA芯片篩選出誘導前后表達差異的miRNAs。Targetscan軟件分析異常表達的miR-148a的靶基因,將野生型或突變型DNMT1的3'-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告基因的下游(DNMT1-wt或DNMT1-mut)并分別與miR-148a mimics(miR-148a模擬物)或scramble(miR-148a陰性對照)共轉染,熒光素酶報告基因實驗驗證所預測的靶基因DNMT1,qRT-PCR和Western blot分別檢測轉染miR-638 mimics和scramble后,對DNMT1的mRNA和蛋白表達的影響。構建miR-148a慢病毒質粒,分別在轉染到MSCs后的第1、7、14和28天后檢測miR-148a對GATA結合因子4(Gata-4)基因上游DNA調控序列CpG甲基化水平的影響、qRT-PCR和Western blot分別檢測轉染miR-148a慢病毒質粒后對心肌特異蛋白:球蛋白重鏈(MHC)和心臟肌鈣蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表達的影響,以及對心肌特異轉錄因子心臟特異性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表達的影響。結果:miRNA芯片篩選5'-aza誘導MSCs向心肌分化后表達異常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表達明顯上調。Targetscan、熒光素酶報告基因實驗和qRT-PCR驗證DNMT1是miR-148a直接調控的靶基因。miR-148a慢病毒感染MSCs細胞,證實在轉染的不同時間,Gata-4上游基因甲基化水平發(fā)生改變,且隨著轉染時間延長,Gata-4甲基化水平呈不斷降低趨勢,MSCs細胞內MHC和c Tn T表達提高,CD90和CD29表達降低,Nkx2.5和Gata-4表達提高,MSCs細胞出現向心肌分化。結論:miR-148a可通過靶向調控DNMT1而調控MSCs細胞的向心肌分化。
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【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院兒科;
【基金】：2015年重慶市第八批應用技術研究計劃項目(No.cstc2015jcyjA 10042) 2015年重慶市永川區(qū)科技計劃項目(No.Ycstc,2015nc5003)
【分類號】：R329.2
【正文快照】： 骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,2000和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司。蛋白MSCs)是存在于骨髓中的干細胞,不同誘導條件下,提取試劑盒、ECL增強化學發(fā)光試劑盒和BCA蛋白MSCs可分化為中胚層或外胚層組織細胞,如成骨細定量檢測試劑盒均購于美國Thermo公司。基因組

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本文編號：1354095