本文關鍵詞：分子佐劑C3d3增強Lb.hCGβ-C3d3乳酸桿菌粘膜疫苗抗生育潛能的分子機制　出處：《復旦大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：免疫避孕疫苗作為一種新的節(jié)育措施近年來越來越受關注,其中以hCGβ為基礎的避孕疫苗是近年來研究得最為成熟的一種；通過在生育期婦女體內(nèi)誘導產(chǎn)生抗hCGβ體液免疫以中和hCG生物學活性,從而發(fā)揮抗生育作用。升調(diào)節(jié)淋巴細胞歸巢到生殖道黏膜局部,將有利于增強粘膜體液免疫效應,從而有助于提高避孕疫苗的避孕效果。我們實驗室前期成功構建了分泌hCGβ及攜分子佐劑C3d3的hCGβ-C3d3融合蛋白重組乳酸桿菌。并已研究證明,通過黏膜接種BALB/c小鼠,能產(chǎn)生抗hCGβ體液免疫應答,但其抗生育作用尚不能完全肯定。因此本實驗擬對這種表達hCGp-C3d3融合蛋白重組乳酸桿菌的抗生育潛能,及其免疫后淋巴細胞歸巢機制進行研究,為其最終應用于臨床以及提高其有效性提供實驗依據(jù)。 第一部分重組乳酸桿菌Lb.hCGβ-C3d3陰道黏膜免疫的抗生育潛能 目的探討表達hCGβ-C3d3融合蛋白的重組乳酸桿菌疫苗經(jīng)陰道黏膜接種BALB/c小鼠及其抗生育潛能。 方法用野生型乳酸桿菌Lb.及重組乳酸桿菌Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3以兩種劑量(109個和1010個)經(jīng)陰道滴注接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠。3周后用相同劑量加強免疫一次。于初次免疫后的第6、7、8周分別收集血清；用該血清分別處理MLTC-1、BeWo細胞系,及原代人絨毛滋養(yǎng)細胞；化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)上清中孕酮或hCGβ水平；ELISA檢測培養(yǎng)上清中的hPL水平；免疫熒光觀察抗血清處理的BeWo細胞融合情況。 結果用1010個Lb.hCGβ-C3d3陰道黏膜免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生的抗血清能顯著抑制hCG刺激MLTC-1分泌孕酮及人滋養(yǎng)細胞分泌hCGβ和hPL,明顯抑制BeWo細胞分泌hCGβ及細胞融合。 結論重組乳酸桿菌活疫苗Lb.hCGβ-C3d3經(jīng)陰道接種誘導的hCGβ抗體可拮抗hCGβ生物學活性,并干擾合體滋養(yǎng)細胞形成,因此具有抗生育潛能。 第二部分分子佐劑C3d3促進陰道粘膜免疫中淋巴細胞歸巢 目的探討表達hCGβ-C3d3融合蛋白的重組乳酸桿菌活疫苗經(jīng)陰道黏膜接種后分子佐劑C3d3促進淋巴細胞歸巢的分子機制。 方法用野生型乳酸桿菌Lb.及重組乳酸桿菌Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3以1010個菌的劑量經(jīng)陰道滴注接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠。3周后用相同劑量加強免疫一次。于加強免疫后第二周,以免疫磁珠分離免疫鼠的脾臟T、B淋巴細胞,經(jīng)體外熒光標記后,分別經(jīng)尾靜脈過繼轉(zhuǎn)輸給加強免疫后第二周的免疫小鼠。過繼轉(zhuǎn)輸后96h,以雙光子共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)輸細胞在各免疫組宿主鼠子宮陰道的歸巢情況；Western blot分析加強免疫后第二周各免疫組子宮和陰道組織E-鈣黏蛋白和E-選擇素的表達。 結果在過繼轉(zhuǎn)輸?shù)腡、B淋巴細胞24h后,CFSE綠色熒光示蹤的T、B細胞均能歸巢到宿主子宮內(nèi)膜,并呈時間依賴性,在過繼轉(zhuǎn)輸后96h歸巢的細胞數(shù)最多：但未發(fā)現(xiàn)陰道組織明顯免疫活性細胞歸巢。在重組乳酸桿菌Lb.hCGβ-C3d3免疫組,熒光標記的T、B淋巴細胞歸巢至小鼠子宮內(nèi)膜明顯增加；在腹腔注射抗CCL25中和性抗體后,宿主小鼠子宮內(nèi)膜中CFSE熒光標記的B淋巴細胞數(shù)量顯著減少,而熒光標記的T淋巴細胞數(shù)量減少不明顯。和Lb.及Lb.hCGβ免疫組相比,Lb.hCGβ-C3d3免疫組的小鼠子宮和陰道組織的E-鈣黏蛋白和E-選擇素的表達量均明顯增加。 結論在重組乳酸桿菌經(jīng)陰道黏膜免疫后,分子佐劑C3d3增加淋巴細胞對子宮內(nèi)膜的歸巢；趨化因子CCL25介導B淋巴細胞歸巢到子宮局部。分子佐劑C3d3通過增加子宮陰道局部E-cadherin、E-selectin表達,有利于淋巴細胞粘附定居于生殖道,增強黏膜免疫體液應答。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1354008