本文關(guān)鍵詞：爆發(fā)性肝炎小鼠中髓系衍生抑制性細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞活性影響的研究　出處：《浙江大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：爆發(fā)性肝炎發(fā)病迅速,病情重,死亡率高,是目前醫(yī)學(xué)難題之一。機(jī)體的免疫應(yīng)答異常是其特征,人體免疫系統(tǒng)功能的變化與肝炎的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著密切的聯(lián)系。肝臟中含有大量參與天然免疫應(yīng)答的細(xì)胞,如NK細(xì)胞、MΦ、NKT和γdT細(xì)胞。近年來(lái),具有免疫抑制性的細(xì)胞亞群表型為Gr1+CD11b+的髓系衍生抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)越來(lái)越受到研究人員的重視,MDSC是髓系來(lái)源的異質(zhì)性細(xì)胞群體,包括髓系祖細(xì)胞和未成熟的髓系細(xì)胞。已有研究表明,MDSCs在機(jī)體腫瘤、炎癥和感染等疾病的免疫應(yīng)答中起負(fù)向調(diào)控作用。本研究就爆發(fā)性肝炎發(fā)展過(guò)程中MDSCs對(duì)固有免疫NK細(xì)胞的影響展開(kāi)研究。 結(jié)合已有的研究報(bào)道,我們以C57/BL6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,制備了內(nèi)毒素引起的爆發(fā)性肝炎模型,基于該模型檢測(cè)爆發(fā)性肝炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,MDSCs與NK細(xì)胞數(shù)量比例以及NK殺傷活性變化,研究爆發(fā)性肝炎過(guò)程中MDSCs對(duì)NK細(xì)胞活性的影響,以期對(duì)爆發(fā)性肝炎的發(fā)病機(jī)制有更深入的了解,并為爆發(fā)性肝炎的防治提供一定的思路。 第一部分：小鼠爆發(fā)性肝炎模型的建立與鑒定 以C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)腹腔注射脂多糖(LPS) (5μg/kg)和D-半乳糖胺(D-GalN) (450mg/kg)來(lái)制備小鼠爆發(fā)性肝炎模型,利用D-GalN輔助下的內(nèi)毒素中毒來(lái)?yè)p傷肝臟,模擬爆發(fā)性肝炎,檢測(cè)其肝炎的發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r。 首先,我們成功制備了小鼠爆發(fā)性肝炎模型并觀察了其生存時(shí)間。造模小鼠在6.5h后部分出現(xiàn)死亡,7h-8h 75%的小鼠死亡,并在10h內(nèi)全部死亡。利用該現(xiàn)象,我們進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠造模后0h、1.5h、3h和6h時(shí)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量,數(shù)據(jù)表明,小鼠腹腔注射LPS/D-GalN后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)血清AST和ALT的含量均顯著升高,6h時(shí)血清AST和ALT的含量均顯著高于1.5h和3h時(shí)血清AST和ALT的含量。同時(shí),我們還對(duì)各時(shí)間點(diǎn)造模小鼠的肝臟進(jìn)行了病理學(xué)檢查。病理切片顯示注射LPS/D-GalN 1.5h肝臟病理切片示肝細(xì)胞有較多的核分裂,有散在的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；3h肝臟病理切片示肝細(xì)胞有較多的核分裂,有散在的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),部分區(qū)域呈小灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),有部分肝細(xì)胞死亡；6h肝臟病理切片示肝細(xì)胞有較多的核分裂,有較多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),局部呈小灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),其周圍有大量肝細(xì)胞死亡。上述結(jié)果表明爆發(fā)性肝炎模型隨著時(shí)間的推移,肝臟炎癥顯著加重,逐漸出現(xiàn)肝臟壞死。 第二部分：小鼠爆發(fā)性肝炎發(fā)展過(guò)程中MDSCs對(duì)NK細(xì)胞及其活性的影響 我們從爆發(fā)性肝炎模型小鼠0h、1.5h、3h和6h時(shí)肝臟、脾臟、骨髓和淋巴結(jié)組織中分離出單個(gè)核細(xì)胞,用FITC-anti-Gr1和PE-anti-CD11b抗體標(biāo)記細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Gr1+CD11b+MDSCs的細(xì)胞比例；用PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD3-NK1.1+NK細(xì)胞的比例；用FITC-anti-NKG2D、PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟、脾臟和骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)NKG2D+NK細(xì)胞的比例以及NKG2D的平均熒光強(qiáng)度。 結(jié)果顯示,肝臟、脾臟、骨髓和淋巴結(jié)組織中的MDSCs隨著爆發(fā)性肝炎的發(fā)展逐漸聚集,同時(shí)肝臟中的NK細(xì)胞數(shù)量隨著爆發(fā)性肝炎的發(fā)展也不斷增加,且表達(dá)活化受體NKG2D的NK細(xì)胞比例在肝炎爆發(fā)狀態(tài)時(shí)也出現(xiàn)了顯著升高,NK細(xì)胞活化受體NKG2D的平均熒光強(qiáng)度也隨著爆發(fā)性肝炎的發(fā)展顯著增強(qiáng)。表明了伴隨爆發(fā)性肝炎的發(fā)展,MDSCs及NK細(xì)胞均逐漸增多,NK細(xì)胞活性也隨之加強(qiáng)。 第三部分：小鼠爆發(fā)性肝炎發(fā)展過(guò)程中剔除MDSCs與對(duì)NK細(xì)胞的影響 利用Rb6雜交瘤細(xì)胞,通過(guò)裸鼠制備具有MDSCs剔除功能的單克隆抗體,然后對(duì)制備的anti-Gr-1 mAb進(jìn)行體內(nèi)剔除效果的鑒定。C57BL/6小鼠腹腔注射該單克隆抗體后,小鼠肝臟、脾臟和骨髓中細(xì)胞Gr1+CD11b+MDSCs的細(xì)胞比例顯著下降至1%左右,剔除效果明顯。 隨后以anti-Gr-1 mAb制備MDSCs剔除的小鼠,在此基礎(chǔ)上,用PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)了爆發(fā)性肝炎模型6h時(shí)間點(diǎn)肝臟細(xì)胞中CD3-NK1.1+NK細(xì)胞的比例；并用FITC-anti-NKG2D、PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟、脾臟和骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)爆發(fā)性肝炎模型6h時(shí)間點(diǎn)NKG2D+NK細(xì)胞的比例以及NKG2D的平均熒光強(qiáng)度。 結(jié)果顯示,MDSCs剔除后爆發(fā)性肝炎6h時(shí)間點(diǎn)肝臟中NK細(xì)胞的比例顯著高于未剔除組同一時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞的比例。另外,體內(nèi)剔除MDSCs后,小鼠爆發(fā)性肝炎6h時(shí)間點(diǎn)肝臟、脾臟和骨髓中NK細(xì)胞表達(dá)活化受體NKG2D的細(xì)胞比例與NKG2D的熒光強(qiáng)度均顯著降低,表明爆發(fā)性肝炎模型小鼠肝臟中MDSCs顯著抑制了NK細(xì)胞的比例。 綜上所述,隨著爆發(fā)性肝炎的發(fā)展,Gr1+CD11b+MDSCs在不同組織器官中快速增殖,肝臟中CD3-NK1.1+NK細(xì)胞的數(shù)量也不斷增加,剔除MDSCs促進(jìn)NK細(xì)胞比例的增加,表明MDSCs在肝臟炎癥發(fā)展過(guò)程中一定程度抑制了NK細(xì)胞數(shù)量的增加,但無(wú)法根本性地扭轉(zhuǎn)肝炎的急性爆發(fā)及NK細(xì)胞活性增強(qiáng)導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷,本研究對(duì)于爆發(fā)性肝炎的發(fā)病機(jī)制及治療提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 George Kolios;Vassilis Valatas;Elias Kouroumalis;;Role of Kupffer cells in the pathogenesis of liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2006年46期

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本文編號(hào)：1349880