本文關鍵詞：腸出血性大腸桿菌O157:H7大質(zhì)粒pO157的致病機制研究　出處：《中國疾病預防控制中心》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：腸出血性大腸桿菌(EHEC) O157:H7是一種食源性病原菌,能夠引起出血性腹瀉(HC),甚至溶血性尿毒綜合征(HUS)等危及生命的疾病。大部分的臨床分離菌株都含有一個約92kb的致病性大質(zhì)粒pO157, pO157在EHEC O157:H7致病中的作用仍不十分清楚。在本研究中,我們通過比較EHEC O157:H7野生株EDL933和其大質(zhì)粒缺失菌株ΔpO157在體外粘附能力、抗吞噬能力、對人外周血單個核細胞(PBMC)和巨噬細胞毒性作用、刺激人PBMC和巨噬細胞生成細胞因子方面,來探索大質(zhì)粒在EHEC O157:H7致病過程中的作用。結果顯示,在體外粘附實驗中,ΔpO157對上皮細胞的粘附能力弱于野生株。利用乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗和細胞脫落實驗,我們發(fā)現(xiàn)ΔPO157對人PBMC和巨噬細胞毒性作用顯著低于野生株。同時我們檢測了這兩株細菌刺激人PBMC和巨噬細胞生成的細胞因子,發(fā)現(xiàn)野生株刺激PBMC生成白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的生成水平遠遠高于大質(zhì)粒缺失株Δp0157；野生株和缺失株均不能刺激人巨噬細胞生成IL-6和IL-10,能生成TNF-a、IL-8、MCP-1、RANETS和IL-1β。其中只有IL-1β的水平在二者之間存在顯著差異,野生株刺激IL-1β的生成水平遠遠高于大質(zhì)粒缺失株Ap0157。提示大質(zhì)粒在粘附、致PBMC和巨噬細胞毒性作用、刺激PBMC和巨噬細胞生成細胞因子方面起到了重要的作用。 為了進一步探索大質(zhì)粒上的哪些基因造成了野生株和大質(zhì)粒缺失株之間的細胞毒和細胞因子差異,我們用一步缺失法構建了大質(zhì)粒上的溶血素A基因的缺失菌株ΔhlyA和絲氨酸蛋白酶基因缺失菌株ΔespP進行上述實驗。結果顯示AespP與野生株在對細胞毒性作用和刺激細胞因子生成方面差異均無統(tǒng)計學意義。而AhlyA的細胞毒性顯著低于野生株,但同Δp0157之間差異無統(tǒng)計學意義,同時AhlyA刺激人巨噬細胞生成IL-1B的水平遠遠低于野生株,高于Δp0157,提示溶血素是致人巨噬細胞產(chǎn)生細胞毒和IL-1B的重要原因。 枸櫞酸桿菌是重要的人類機會致病菌,存在于土壤、水體、食物以及人類和動物的腸道中。枸櫞酸桿菌感染兩個重要的途徑是醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)性感染,菌株分型在流行病學調(diào)查中有著很重要的作用。脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)是目前使用最廣泛的病原菌分子分型方法。本研究目的是優(yōu)化和建立用于枸櫞酸分型的PFGE實驗方案。我們首選對適合枸櫞酸桿菌的限制性內(nèi)切酶進行了選擇,從7種內(nèi)切酶中挑選XbaⅠ和BlnⅠ為內(nèi)切酶,并且確定了電泳參數(shù)為1s—20 s,19h。隨后,我們對膠塊制備過程中的菌懸液濃度(2.5—3.5濁度)、SDS的使用(不需要使用SDS)和菌細胞裂解時間(1h)進行了優(yōu)化。同時,我們對其分辨力、分型力和重復性進行了評價。結果顯示,兩種內(nèi)切酶進行分型均具有很好的分型力和重復性；BlnⅠ-PFGE具有比XbaⅠ-PFGE更高的分辨力,所以我們推薦以BlnⅠ為首選內(nèi)切酶,XbaⅠ為備選內(nèi)切酶。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【引證文獻】

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1 趙姝靜;大腸桿菌腸毒素卵黃抗體的制備及其抗毒素特性研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2013年

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本文編號：1349546