本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化及其MASH-1表達(dá)的體外研究　出處：《河北聯(lián)合大學(xué)》2011年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 誘導(dǎo)分化 神經(jīng)細(xì)胞 MASH-1小干涉-RNA Real-time-PCR

【摘要】：目的: 當(dāng)今社會(huì),科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展為人們帶來(lái)高質(zhì)量的生活,但同時(shí)也給人們帶來(lái)了許多傷害,比如汽車(chē)的普及造成越來(lái)越多的交通傷等,而這些傷害往往會(huì)造成人的中樞神經(jīng)(大腦、脊髓)及周?chē)窠?jīng)的損傷,但是至今人們沒(méi)有找到滿(mǎn)意的治療手段。因?yàn)檫^(guò)去人們一直認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞是不可再生的,所以修復(fù)神經(jīng)也是不可能的。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)所具有的多能分化特性為神經(jīng)細(xì)胞再生的研究提供了新的方向和思路,使得神經(jīng)細(xì)胞再生成為可能。本研究擬通過(guò)體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),觀察其生物學(xué)特性;對(duì)培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行單純?chǔ)?巰基乙醇(β-ME)誘導(dǎo),促使其向神經(jīng)細(xì)胞定向分化并對(duì)分化的細(xì)胞加以鑒定。探討誘導(dǎo)后所得細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)規(guī)律以及MASH-1表達(dá)的變化情況,進(jìn)而探討MSCs體外誘導(dǎo)分化的條件、特點(diǎn)和規(guī)律,為MSCs在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 方法: 1. MSCs的分離培養(yǎng):取2月齡SD大鼠,無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨和脛骨,5ml L-DMEM徹底沖洗髓腔獲取骨髓細(xì)胞懸液,Percoll液密度梯度離心與貼壁相結(jié)合分離、純化MSCs,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并換液、傳代。每天在倒置相差顯微鏡下觀察原代、傳代細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀態(tài)。 2.誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化:待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),分別對(duì)第5代、第10代、第15代細(xì)胞,進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)和正式誘導(dǎo)。首先加入L-DMEM + 1mmol/Lβ-ME + 20%FBS預(yù)誘導(dǎo)24h后,分兩組用不同方法繼續(xù)誘導(dǎo),第一組加入L-DMEM + 5mmol/Lβ-ME誘導(dǎo)5h,第二組(對(duì)照組)加入L-DMEM + PBS誘導(dǎo)5h。倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化。 3.神經(jīng)細(xì)胞鑒定:用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)神經(jīng)前體細(xì)胞特異標(biāo)志物:神經(jīng)巢蛋白(Nestin);神經(jīng)元特異標(biāo)志物:神經(jīng)元中間絲蛋白(NF)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE);神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物:膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。 4.對(duì)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行尼氏染色。 5.構(gòu)建可以表達(dá)針對(duì)MASH-1的小干涉RNA(siRNA)的干涉載體,使用Lipofenectin2000轉(zhuǎn)染至大鼠MSCs,同樣方法轉(zhuǎn)染干擾組和對(duì)照組,其中干擾組加入干擾的無(wú)義序列siRNA,對(duì)照組加入等量的PBS。 6. Real-time PCR法檢測(cè)MASH-1誘導(dǎo)前后表達(dá)的變化情況。 結(jié)果: 1. MSCs分離培養(yǎng):MSCs貼壁生長(zhǎng),培養(yǎng)的各代細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定,以成纖維狀細(xì)胞為主,細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形。傳代后細(xì)胞形態(tài)和原代細(xì)胞相似,無(wú)衰老征象。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞增殖更快,前15代細(xì)胞7-9d可達(dá)到融合。 2. MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化:MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后形態(tài)變化明顯,胞體收縮成錐形、球形,突起增多,表現(xiàn)出典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài);誘導(dǎo)后形態(tài)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,直到5h達(dá)高峰,持續(xù)約2-3h,7-8h后細(xì)胞開(kāi)始脫落、凋亡,到24h后幾乎全部凋亡。誘導(dǎo)4-5h后形態(tài)轉(zhuǎn)化率達(dá)到高峰。第5代、第10代、第15代細(xì)胞誘導(dǎo)5h后形態(tài)轉(zhuǎn)化率分別為84.70±5.42%、84.70±4.42%、86.10±3.81%,經(jīng)檢驗(yàn)三者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)照組無(wú)明顯變化。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果:免疫組化染色未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs的NESTIN、NSE、NF和GFAP均為陰性;細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)5h后,NESTIN表達(dá)較誘導(dǎo)1h減弱,而NSE、NF、GFAP表達(dá)明顯增高。第5代MSCs經(jīng)誘導(dǎo)5h后NESTIN、NSE、NF、GFAP的表達(dá)率分別為:82.25±1.59%、85.79±2.79%、80.71±5.68%、45.71±3.12%。第5、10、15三代細(xì)胞各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)率相似,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)照組細(xì)胞以上各指標(biāo)均表達(dá)為陰性。 4.尼氏小體染色:誘導(dǎo)1h及5h后形態(tài)典型的細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)深藍(lán)色塊狀或顆粒狀的尼氏小體;未誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞的胞漿內(nèi)無(wú)尼氏小體。 5.利用Real-time PCR法分別檢測(cè)正常組、干擾組、MASH-1-siRNA組MASH-1的表達(dá)水平。各組MASH-1的Ct值均經(jīng)β-actin矯正,以正常組的表達(dá)作為100%。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組MSCs細(xì)胞中MASH-1的mRNA的平均表達(dá)為0.09473±0.008537,遠(yuǎn)低于空白組0.46593±0.01823和陰性對(duì)照組0.4583±0.02141,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0.01)。 結(jié)論: 1.離心與貼壁相結(jié)合是一種簡(jiǎn)便、有效的分離、純化、擴(kuò)增MSCs的方法。 2. MSCs經(jīng)β-ME單純誘導(dǎo)后可分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 3.誘導(dǎo)后細(xì)胞具有成熟期神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征(存在尼氏小體),說(shuō)明該細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上已具備成熟神經(jīng)元的某些特征。 4. MASH-1-mRNA在大鼠MSCs中高表達(dá),無(wú)義序列的siRNA并不能降低這種表達(dá),但特異性的MASH-1-siRNA卻可明顯抑制MASH-1-mRNA的表達(dá),同正常組或干擾組比較,差異具有顯著性(P0.01),說(shuō)明特異性的轉(zhuǎn)染MASH-1-siRNA可抑制大鼠MSCs表達(dá)MASH-1。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北聯(lián)合大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋玉成;劉永海;張尊勝;沈霞;;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞及其分化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;2006年01期

2 閆磊;慕曉玲;;成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性鑒定[J];中國(guó)臨床保健雜志;2008年02期

3 晏丹;舒賽男;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年01期

4 李方華;侯玲玲;蘇曉華;鄭揚(yáng);龐全海;關(guān)偉軍;馬月輝;;RNA干擾的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2010年05期

5 孫麗哲;侯林;;Notch的結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)信號(hào)通路[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2010年06期

6 王相利;宓寶杰;王海立;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中神經(jīng)生長(zhǎng)因子及受體的表達(dá)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年33期

7 王慶德;連鴻凱;王春萍;王春麗;白玉;;成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化及多向分化的能力[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年49期

8 吳剛;何輝;曹月誠(chéng);陳旭春;楊蕾;富大智;;不同血清培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年49期

9 李雪峰;王東;孫海鈺;;骨組織工程中骨髓基質(zhì)細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2007年01期

10 王煥明;徐如祥;;中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞移植[J];醫(yī)學(xué)綜述;2007年01期

，

本文編號(hào)：1348532