本文關(guān)鍵詞：多價(jià)登革熱病毒樣顆粒疫苗的研究　出處：《中國疾病預(yù)防控制中心》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：登革病毒(DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬,包括四個(gè)血清型,以伊蚊為主要傳播媒介,可引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征。登革病毒感染是當(dāng)今世界上分布最廣的一種蟲媒病毒病。據(jù)WHO估計(jì),全球有25-30億人口面臨感染登革病毒的危險(xiǎn),每年因登革病毒感染死亡的人數(shù)約為2.5萬。目前,登革病毒的感染機(jī)制仍不明確,并且由于各血清型之間缺乏有效交叉保護(hù),存在抗體依賴增強(qiáng)作用,至今尚無安全有效的疫苗推廣應(yīng)用。 病毒樣顆粒(VLPs)疫苗是近年來發(fā)展起來的一種新型亞單位疫苗,目前己應(yīng)用于一些病毒性疾病的預(yù)防控制中,也為登革疫苗的研究提供了新的思路。VLPs具有與天然病毒顆粒相同或相似的結(jié)構(gòu)而沒有病毒核酸,不能自主復(fù)制,沒有毒力回復(fù)的可能,因此具有較好的免疫原性和安全性,是一種很好的登革疫苗候選物。 登革病毒為單股正鏈RNA病毒,基因組長約11kb,含有一條單一開放讀碼框。編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。其中E基因編碼的E蛋白是病毒的主要包膜糖蛋白,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,是登革病毒的主要保護(hù)性抗原。prM基因編碼的prM蛋白為膜蛋白M的前體,是病毒誘發(fā)保護(hù)性免疫的重要協(xié)同成分,此外還有助于E蛋白的正確折疊及其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。對于黃病毒屬成員而言,共表達(dá)prM蛋白和E蛋白可形成病毒樣顆粒。本研究的主要目的是用prM基因和E基因構(gòu)建四個(gè)型別登革病毒的病毒樣顆粒,并初步研究其免疫原性,為研制四價(jià)登革病毒樣顆粒疫苗奠定基礎(chǔ)。 由于天然登革病毒顆粒通過細(xì)胞分泌途徑被運(yùn)送至胞外,而真核表達(dá)系統(tǒng)具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工修飾功能及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,有利于VLPs的正確組裝,其表達(dá)的蛋白質(zhì)更接近天然病毒抗原,具有較為完整的生物學(xué)功能。因此,本研究選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行登革病毒樣顆粒的分泌表達(dá)研究。我們首先對登革病毒的prM-E基因進(jìn)行特性分析及分泌表達(dá)設(shè)計(jì),并通過融合PCR方法對表達(dá)元件進(jìn)行改造,包括：1)在登革病毒prM基因前添加一段來源于乙型腦炎病毒(JEV)的信號肽序列(JESS); 2)將1-4型登革病毒E基因3'端20%區(qū)域缺失或替換為JEV E基因的相應(yīng)部分。我們將改造后的相應(yīng)基因元件分別克隆至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA5/FRT及桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pAcUW51-M、PAcGP67-B及pAcSecG2T中,構(gòu)建了一系列經(jīng)酶切鑒定及序列測定均正確的登革病毒樣顆粒重組表達(dá)質(zhì)粒。 為了研究上述重組表達(dá)載體分泌表達(dá)登革病毒樣顆粒的能力,我們將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞或Sf9細(xì)胞,并通過間接免疫熒光、Western blot方法檢測登革VLPs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與分泌情況。結(jié)果顯示,所有重組載體轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞后,prM-E蛋白在細(xì)胞內(nèi)均得到有效的表達(dá)。同時(shí),在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中,我們實(shí)現(xiàn)了全部四個(gè)型別登革病毒樣顆粒的分泌表達(dá),而在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中,僅有攜帶乙腦信號肽的DENV-1 prME克隆至pAcUW51-M載體后,染毒上清中隱約可見目的條帶,其他質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的染毒上清中均未檢測到目的蛋白的分泌表達(dá)。因此,我們選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為登革病毒樣顆粒的表達(dá)系統(tǒng),并最終確定PJD1prME、pJD2-D4prMEA20%JEV作為1-4型登革病毒樣粒的重組表達(dá)載體。在上述研究基礎(chǔ)上,我們分別將pJD1prME、pJD2-D4prME△20%JEV大量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行1-4型登革病毒樣顆粒的大量制備,轉(zhuǎn)染上清經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后,在電鏡下可觀察到類似天然登革病毒顆粒的結(jié)構(gòu)。 最后,我們對單價(jià)及四價(jià)登革病毒樣顆粒的免疫原性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示登革1、2、3、4型VLPs具有良好的免疫原性,單價(jià)及四價(jià)等量配伍免疫時(shí)均能刺激小鼠產(chǎn)生抗登革rEⅢ蛋白的特異性IgG抗體,間接免疫熒光檢測顯示小鼠免疫血清能與表達(dá)1-4型登革病毒prM-E蛋白的Sf9細(xì)胞起陽性反應(yīng)。中和試驗(yàn)測定顯示單價(jià)免疫時(shí),四個(gè)型別登革病毒樣顆粒能刺激小鼠產(chǎn)生針對同型病毒的中和抗體,中和效價(jià)最高可達(dá)1：20,四價(jià)等量配伍免疫時(shí),可刺激小鼠產(chǎn)生針對全部四個(gè)型別登革病毒的中和抗體。此外,單價(jià)及四價(jià)登革VLPs均可刺激一定水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 綜上所述,本研究成功構(gòu)建了1-4型登革病毒樣顆粒的重組表達(dá)載體,并利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了全部四個(gè)型別登革VLPs的分泌表達(dá),在透射電鏡下觀察到了形態(tài)結(jié)構(gòu)類似天然登革病毒的顆粒。在此基礎(chǔ)上對單價(jià)及四價(jià)登革病毒樣顆粒的免疫原性進(jìn)行研究,結(jié)果顯示本研究所構(gòu)建的病毒樣顆粒能刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生登革特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。以上結(jié)果為登革病毒樣顆粒疫苗的研究奠定了良好基礎(chǔ),也為研究登革病毒新型疫苗進(jìn)行了有益的探索。隨著研究的深入,可對prM-E基因表達(dá)元件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,以提高登革病毒樣顆粒的表達(dá)量,也可改善免疫策略,以獲得更好的免疫效果。同時(shí)登革病毒樣顆粒也可作為診斷抗原應(yīng)用于登革熱血清學(xué)診斷中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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