本文關(guān)鍵詞：人α防御素-5抗人乳頭瘤病毒作用及相關(guān)機制研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：防御素是人們在研究哺乳動物、昆蟲等防御和抵抗病原微生物侵襲及感染過程中發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性陽離子多肽，因其具有廣譜抗菌作用以及不易產(chǎn)生耐藥的特點而被寄厚望成為新一代抗生素。近年來越來越多的研究表明，除了具有抗菌活性，防御素還具有顯著的抗病毒作用。此外，人們發(fā)現(xiàn)防御素作為天然免疫防線的重要成員，除可以直接殺傷、抑制病原微生物感染外，它還具有調(diào)節(jié)或激活免疫反應(yīng)的作用，使其間接的協(xié)助機體抵抗病原微生物感染。人α防御素-5(human defensin-5，HD-5)主要由腸道Paneth細(xì)胞和女性生殖道粘膜上皮細(xì)胞表達和分泌，另外在尿道上皮組織中也檢測到HD-5的存在。正是由于這些區(qū)域經(jīng)常受到外來微生物的侵入，環(huán)境選擇導(dǎo)致的進化壓力造就了HD-5具有突出的抗病原微生物活性，因此更具開發(fā)應(yīng)用價值。 對于防御素的抗病毒作用，人們研究較多、較深入的是其抗包膜病毒如HIV、HSV等的作用，有關(guān)防御素對無包膜病毒的抗感染作用尚未引起人們的充分關(guān)注。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)作為通過性傳播感染的常見的病原體，是一種典型的無包膜DNA病毒，約75%的人群在其一生中均會受到HPV感染；其主要侵害人生殖器、肛門以及口咽部位的上皮細(xì)胞。研究表明，高危型HPV的感染與一些肛門生殖器區(qū)腫瘤的發(fā)生之間有著一定關(guān)聯(lián)，其中HPV16、HPV18亞型的長期感染已經(jīng)被證實為宮頸癌發(fā)生的一個主要誘因。而目市面上還前沒有針對HPV感染的特異性藥物，因此深入研究HD-5的抗HPV作用，有望為防治HPV感染尋找新的治療途徑。 由于HPV對宿主細(xì)胞有嚴(yán)格的特異性而且其增殖也依賴皮膚或黏膜細(xì)胞的分化，因此應(yīng)用常規(guī)的組織培養(yǎng)技術(shù)不易進行大量制備；另外，從病變組織中分離獲取足夠數(shù)量的病毒用于抗病毒藥物的藥效評價也十分困難。隨著HPV假病毒制備技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)能夠通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，較簡單地使目的HPV病毒體在外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)進行增殖、表達和組裝，并最終獲得足夠高滴度且包裹有熒光報告基因的HPV假病毒，從而便于病毒感染程度的直接觀察和定量分析。 另外，由于防御素分子內(nèi)存在著3對二硫鍵，采用化學(xué)合成法對其制備存在著很大的技術(shù)難度，從而在一定程度上限制了其開發(fā)與推廣應(yīng)用。至于二硫鍵對防御素活性的影響，人們的認(rèn)識并不一致，有些研究認(rèn)為二硫鍵可以顯著影響防御素的抗微生物活性；但也有研究認(rèn)為防御素的抗微生物活性主要與其所帶正電荷的多少有關(guān)，而與二硫鍵的存在與否關(guān)系不大。近來有文獻報道，二硫鍵的缺失不會顯著影響人β防御素3的抗菌活性，而去除了二硫鍵和半胱氨酸的防御素或其衍生多肽則比較容易通過化學(xué)合成法進行生產(chǎn)和制備。HD-5分子中的二硫鍵和半胱氨酸是否會影響其抗病毒活性，化學(xué)合成的HD-5線性多肽是否還具有抗病毒作用，這些都還缺乏深入研究。揭示二硫鍵及半胱氨酸在HD-5抗病毒活性中的作用，將會為其今后的研制與開發(fā)提供重要參考。 本文利用HPV假病毒研究新技術(shù)首先制備了含綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)報告基因的HPV16假病毒，并建立HPV16假病毒感染宮頸癌細(xì)胞模型，然后采用熒光觀察和流式細(xì)胞分析技術(shù)測定了幾種不同構(gòu)型HD-5多肽的抗HPV16感染作用，同時還觀察了HD-5多肽的趨化作用。具體研究方法包括：通過將表達HPV16病毒衣殼蛋白的質(zhì)粒與GFP報告基因質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，制備包含GFP報告基因的HPV16假病毒并用多種方式進行鑒定，然后通過流式細(xì)胞分析測定GFP表達率來計算病毒滴度；用制備的HPV16假病毒感染3種不同宮頸癌細(xì)胞株，選定最合適的細(xì)胞感染模型；合成HD-5/N(天然構(gòu)型)、HD-5/N-FAM(帶熒光標(biāo)記)、HD-5/Acm(線性合成，半胱氨酸被Acm修飾)、HD-5/Abu(線性合成，半胱氨酸被Abu替換)等HD-5多肽，首先采用激光共聚焦觀察HD-5/N-FAM與細(xì)胞的作用情況，然后采用鏡下熒光觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測在不同HD-5多肽作用48小時后，被HPV16假病毒感染的細(xì)胞中GFP蛋白的表達水平，并計算出多肽對病毒的抑制率；最后，分別用不同構(gòu)型HD-5多肽刺激Caski細(xì)胞，ELISA法檢測細(xì)胞上清中趨化因子IL-8的分泌情況，以觀察HD-5多肽的間接趨化作用，同時，通過Transwell趨化遷移實驗研究不同構(gòu)型HD-5多肽對中性粒細(xì)胞的直接趨化作用。 本文取得了以下主要研究結(jié)果： (1)表達HPV16病毒衣殼蛋白的質(zhì)粒與GFP報告質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，經(jīng)鑒定最終制備出含GFP報告基因的HPV16假病毒，滴度達到2.3×108TU/ml。 (2) HPV-16假病毒能夠感染體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞，其中以C-33a細(xì)胞感染率最高。 (3) HD-5/N能夠劑量依賴性地抑制HPV16假病毒感染C-33a細(xì)胞，在濃度為50μg/ml時，HD-5/N對HPV16假病毒感染的抑制率已接近100%。 (4) HD-5/N-FAM與細(xì)胞作用2~3小時后，共聚焦顯微鏡觀察到HD-5可以大量進入細(xì)胞質(zhì)，并且可能主要集中于內(nèi)吞體、溶酶體中。 (5)濃度為20μg/ml的HD-5/N、HD-5/Acm、HD-5/Abu對HPV16感染C-33a細(xì)胞的抑制率分別為96.48±5.67%、69.02±7.88%和2.71±1.53%。與HD-5/N相比，HD-5/Acm的抗HPV作用顯著降低，而HD-5/Abu則基本失去抗HPV活性。 (6)不同構(gòu)型HD-5刺激Caski細(xì)胞分泌趨化因子IL-8的能力由高到低依次為：HD-5/NHD-5/AcmHD-5/Abu；同樣，HD-5/N直接趨化外周血中性粒細(xì)胞遷移的能力也顯著高于HD-5/Acm和HD-5/Abu。 本文主要結(jié)論： (1)成功構(gòu)建了含GFP報告基因的HPV16假病毒感染宮頸癌細(xì)胞模型，建立了基于流式細(xì)胞分析的抗HPV病毒感染定量檢測方法，為準(zhǔn)確評價HD-5的抗HPV病毒感染作用奠定了基礎(chǔ)。 (2) HD-5/N具有顯著抑制HPV-16病毒感染的作用，，并證實HD-5可以進入細(xì)胞質(zhì)中，提示HD-5可能通過限制病毒顆粒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運、脫衣殼等過程來發(fā)揮抗病毒作用。 (3)與HD-5/N相比，HD-5/Acm的抗HPV16作用明顯減弱，提示二硫鍵對HD-5的抗病毒作用有著顯著影響；與HD-5/Acm相比，HD-5/Abu的抗HPV16作用進一步減弱，提示HD-5多肽抗病毒作用的發(fā)揮依賴于分子中半胱氨酸殘基的存在。 (4) HD-5/Acm、HD-5/Abu的間接和直接趨化作用均較天然結(jié)構(gòu)的HD-5明顯減弱，提示HD-5的趨化作用可能受二級結(jié)構(gòu)影響，HD-5介導(dǎo)的免疫趨化作用可能參與了其抗病毒效應(yīng)的發(fā)揮。
[Abstract]:Defensin is a kind of endogenous cationic peptides found in mammals and insects on defense and resistance to microbial pathogens invasion and infection, due to their broad-spectrum antibacterial effect and the characteristics of low resistance and high hopes to become a new generation of antibiotics. In recent years, more and more studies have shown that, in addition to antibacterial activity, defensins also have significant antiviral effects. In addition, it is found that defensins as an important member of the natural immune line, in addition to directly killing and inhibiting the infection of pathogenic microorganism, it also has the function of regulating or activating the immune response, making it indirectly assist the organism in resisting the infection of pathogenic microorganism. Human alpha defensin -5 (human defensin-5, HD-5) is mainly expressed and secreted by intestinal Paneth cells and female reproductive tract epithelial cells, and HD-5 is also detected in urethral epithelium. It is precisely because these regions are often invaded by foreign microbes. The evolutionary pressure caused by environmental selection has made HD-5 have outstanding resistance to pathogenic microorganisms, so it has more development and application value.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 李廣闊,粟永萍,劉曉宏,艾國平,王軍平,程天民;人小腸粘膜防御素-5 cDNA的克隆與序列分析[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年10期

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本文編號：1347097