本文關鍵詞：MicroRNA-182與淋巴細胞腫瘤糖皮質(zhì)激素耐藥的相關性研究　出處：《復旦大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：MicroRNA-182與淋巴細胞腫瘤糖皮質(zhì)激素耐藥的相關性研究 目的 糖皮質(zhì)激素(GCs)是血液腫瘤化療方案中的一線用藥,而糖皮質(zhì)激素耐藥則是化療失敗的主要原因,導致疾病的難治和復發(fā)。目前關于糖皮質(zhì)激素耐藥機制的研究則是臨床解決攻破的難題之一。FoxO3a是FOXO家族的關鍵成員之一,介導著細胞轉(zhuǎn)導途徑特別在調(diào)控細胞凋亡上,有著特殊的角色作用,且在GCs行使作用中,是不可或缺的參與者。但是FoxO3a的調(diào)控機制非常復雜,很多機制尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性表達的小分子非編碼RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達,已成為當前研究的熱點。本項研究,我們擬探討在淋巴細胞腫瘤中(?)miRNA-182對FoxO3a的調(diào)控以及它們與淋巴細胞腫瘤糖皮質(zhì)激素耐藥的相關性。 方法 a)用qRT-PCR檢測不同糖皮質(zhì)激素敏感性的淋巴細胞腫瘤細胞株的miRNA-182的表達水平。 b)用流式細胞術(FCM)行凋亡檢測,篩選和鑒定糖皮質(zhì)激素敏感淋巴細胞腫瘤細胞株和糖皮質(zhì)激素耐藥的淋巴細胞腫瘤細胞株,以及用CCK-8法進行不同淋巴細胞腫瘤細胞株的糖皮質(zhì)激素耐藥程度比較。 c)用Western blot的方法分別檢測糖皮質(zhì)激素敏感淋巴細胞腫瘤細胞株以及糖皮質(zhì)激素耐藥淋巴細胞腫瘤細胞株在接受糖皮質(zhì)激素預孵育前后總FoxO3a和磷酸化FoxO3a的變化。 d)通過流式細胞儀檢測表達綠色熒光素的淋巴細胞腫瘤細胞評估m(xù)iRNA的轉(zhuǎn)染效率。選擇較高轉(zhuǎn)染效率的細胞株,行(?)niRNA-182過表達,并用RT-PCR檢測過表達miRNA-182后,細胞株miRNA-182的表達量的變化,并用Western blot的方法檢測轉(zhuǎn)染后,糖皮質(zhì)激素預孵育淋巴細胞腫瘤細胞株前后總FoxO3a和磷酸化FoxO3a的變化。 e)在糖皮質(zhì)激素敏感細胞株CCRF-CEM中,過表達miRNA-182 24h后,加入等量糖皮質(zhì)激素孵育48h后收集細胞,用流式細胞術(FCM)行凋亡檢測；同時Western blot檢測Bim蛋白水平。 f)在糖皮質(zhì)激素耐藥細胞株HUT-78中,沉默miRNA-182 24h后,加入等量糖皮質(zhì)激素孵育48h后收集細胞,用流式細胞術(FCM)行凋亡檢測；同時Western blot檢測Bim蛋白水平。 結果 1. miRNA-182在不同淋巴細胞腫瘤細胞株內(nèi)表達各異,耐藥細胞株Jurkat相對表達量最高,Molt-4表達量僅次之,而敏感細胞株SUP-B15以及野生型脾細胞表達量相對極低。 2.淋巴細胞腫瘤細胞株中,糖皮質(zhì)激素耐藥細胞株Jurkat和Molt-4,二者在濃度高達10μM的地塞米松的孵育48h后,凋亡率少于5%；在糖皮質(zhì)激素敏感的脾細胞及SUP-B15細胞株中,分別用100nM地塞米松孵育8h和36h,凋亡容易發(fā)生,凋亡率可達50%以上；另外,不同地塞米松濃度下行凋亡率比較,Jurkat明顯比Molt-4耐藥；而且比較不同地塞米松濃度處理下CCRF-CEM與HUT-78的細胞存活率,CCRF-CEM明顯比HUT-78敏感,耐藥程度明顯低于HUT-78。 3.選擇用轉(zhuǎn)染效率較高的淋巴細胞腫瘤細胞株CCRF-CEM,過表達miRNA-182,總FoxO3a隨著miRNA-182轉(zhuǎn)染量的增加而抑制越明顯,50nM抑制效果最佳,而磷酸化FoxO3a表達水平不受影響。 4.對地塞米松敏感的淋巴細胞腫瘤細胞株受到地塞米松作用后,總FoxO3a升高,磷酸化FoxO3a減少,而對地塞米松耐藥的血液腫瘤細胞株在接受地塞米松處理前后變化不大。 5.過表達miRNA-182,可增強淋巴細胞腫瘤細胞株抵抗糖皮質(zhì)激素誘導的凋亡；在CCRF-CEM細胞株中,過表達miRNA-182, 1μM濃度地塞米松作用下,與空白對照相比,凋亡率被下調(diào),Bim表達量較低。 6.沉默miRNA-182,可增加淋巴細胞腫瘤細胞株對糖皮質(zhì)激素誘導的凋亡；在HUT-78細胞株中,沉默miRNA-182, 10μM濃度地塞米松作用下,凋亡率較空白對照上調(diào),Bim表達量較高。 結論 1.在糖皮質(zhì)激素敏感的淋巴細胞腫瘤細胞株中,其磷酸化FoxO3a水平顯著降低,而總FoxO3a水平升高,但對于糖皮質(zhì)激素耐藥的淋巴細胞腫瘤細胞株,總FoxO3a和磷酸化FoxO3a的水平變化均不大,推斷改變FoxO3a的基因表達水平或者磷酸化狀態(tài)的改變,可能一定程度上影響并反映淋巴細胞腫瘤對糖皮質(zhì)激素的敏感程度。 2. miRNA-182能夠有效下調(diào)淋巴細胞腫瘤的FoxO3a的蛋白表達水平,并呈濃度依賴關系,而非改變磷酸化FoxO3a的蛋白表達水平。 3.外源性干預miRNA-182表達水平,影響著淋巴細胞腫瘤對糖皮質(zhì)激素的敏感性。 4.比較多種淋巴細胞腫瘤細胞株中(?)niRNA-182表達豐度,糖皮質(zhì)激素敏感細胞株表達量相對較低,糖皮質(zhì)激素耐藥細胞株表達量相對較高,推斷淋巴細胞腫瘤糖皮質(zhì)激素耐藥的發(fā)生,可能與細胞內(nèi)異常表達的miRNA-182相關。
[Abstract]:Study on the correlation between MicroRNA-182 and glucocorticoid resistance in lymphocyte tumors
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.4

【參考文獻】

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1 尹玉;李明;李昊;江燕;曹立宇;張洪福;徐曉春;;6種microRNAs在前列腺癌組織中的表達[J];中華男科學雜志;2010年07期

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本文編號：1345119