本文關鍵詞：重組人巨細胞病毒基因在大腸桿菌中的表達　出處：《大連理工大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 人巨細胞病毒 被膜磷蛋白65 包膜糖蛋白gB 原核表達

【摘要】：隨著蛋白質結構與功能研究的日益發(fā)展,獲得大量純化的可溶性目的蛋白質成為這一研究的基礎,在原核系統(tǒng)內表達外源基因是獲得大量目的蛋白質最簡單、最經濟的方法,但是由于原核系統(tǒng)自身不存在翻譯后修飾等特性,使得表達的目的蛋白質常常形成無生物活性的包涵體。因此,嘗試利用不同的原核表達體系獲得可溶性并且結構穩(wěn)定的目的蛋白質成為在原核系統(tǒng)表達蛋白質所要解決的首要問題。 本文通過重疊延伸PCR方法獲得人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)被膜磷蛋白pp65362-504與包膜糖蛋白gB607-621融合基因,分別構建原核表達載體pET21b(+)、pTYB11、pPAL7、pCW-ori、pMAL-c2X并在大腸桿菌中進行表達。重組目的基因的pET21b (+)、pTYB11、pPAL7原核表達載體,經過IPTG誘導表達,目的蛋白質以包涵體形式存在,通過改變誘導溫度及IPTG濃度,目的蛋白質依然以不可溶的包涵體形式存在。重組目的基因的pCW-ori原核表達載體,通過IPTG誘導表達,SDS-PAGE電泳驗證,蛋白質以可溶形式存在,gB蛋白單克隆抗體Western Blot證實目的蛋白得到表達,說明目的蛋白質以可溶性形式存在；通過Ni-柱親和層析、SepharoseQ-FF陰離子交換層析和Superdex 75凝膠過濾層析對目的蛋白質進行分離純化,得到單一條帶蛋白質,采用質譜對分離得到的目的蛋白質進行精密分子量分析,結果顯示,分離得到的單一蛋白質產物,大小為12.856KDa和14.4KDa,與目的蛋白質預期分子量大小存在差距。重組目的基因的pMAL-c2X表達載體,經IPTG誘導表達,融合蛋白質存在于可溶性上清中,經Amylose柱一步純化,純化產物經Factor Xa蛋白酶切割,目的蛋白消失。 研究表明,原核細胞內實現重組人巨細胞病毒pp65362-504-gB607-621可溶性表達并且獲得結構穩(wěn)定的蛋白的目標尚難實現。實現pp65362-504-gB607-621融合基因可溶性表達并且獲得結構穩(wěn)定的蛋白質仍需進一步探索,為了獲得結構穩(wěn)定并且可溶的目的蛋白質,可以考慮將目的蛋白質分泌到周質空間或胞外進行目的蛋白質分泌表達。
[Abstract]:With the increasing development of the study of protein structure and function, to obtain a large number of purified soluble protein became the basis of the study, the prokaryotic expression of exogenous gene is the method to obtain the amount of target protein in the easiest and most economical, but because the prokaryotic system itself does not exist modification after translation characteristics, the purpose of protein expression often the formation of inclusion bodies with no biological activity. Therefore, trying to use different prokaryotic expression system to get soluble and stable target protein is the primary problem to solve in prokaryotic system.
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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本文編號：1345118