本文關(guān)鍵詞：重組人巨細(xì)胞病毒基因在大腸桿菌中的表達(dá)　出處：《大連理工大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 人巨細(xì)胞病毒 被膜磷蛋白65 包膜糖蛋白gB 原核表達(dá)

【摘要】：隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的日益發(fā)展,獲得大量純化的可溶性目的蛋白質(zhì)成為這一研究的基礎(chǔ),在原核系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)外源基因是獲得大量目的蛋白質(zhì)最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的方法,但是由于原核系統(tǒng)自身不存在翻譯后修飾等特性,使得表達(dá)的目的蛋白質(zhì)常常形成無(wú)生物活性的包涵體。因此,嘗試?yán)貌煌脑吮磉_(dá)體系獲得可溶性并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的目的蛋白質(zhì)成為在原核系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)所要解決的首要問(wèn)題。 本文通過(guò)重疊延伸PCR方法獲得人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)被膜磷蛋白pp65362-504與包膜糖蛋白gB607-621融合基因,分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET21b(+)、pTYB11、pPAL7、pCW-ori、pMAL-c2X并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。重組目的基因的pET21b (+)、pTYB11、pPAL7原核表達(dá)載體,經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),目的蛋白質(zhì)以包涵體形式存在,通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度,目的蛋白質(zhì)依然以不可溶的包涵體形式存在。重組目的基因的pCW-ori原核表達(dá)載體,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳驗(yàn)證,蛋白質(zhì)以可溶形式存在,gB蛋白單克隆抗體Western Blot證實(shí)目的蛋白得到表達(dá),說(shuō)明目的蛋白質(zhì)以可溶性形式存在；通過(guò)Ni-柱親和層析、SepharoseQ-FF陰離子交換層析和Superdex 75凝膠過(guò)濾層析對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化,得到單一條帶蛋白質(zhì),采用質(zhì)譜對(duì)分離得到的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行精密分子量分析,結(jié)果顯示,分離得到的單一蛋白質(zhì)產(chǎn)物,大小為12.856KDa和14.4KDa,與目的蛋白質(zhì)預(yù)期分子量大小存在差距。重組目的基因的pMAL-c2X表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),融合蛋白質(zhì)存在于可溶性上清中,經(jīng)Amylose柱一步純化,純化產(chǎn)物經(jīng)Factor Xa蛋白酶切割,目的蛋白消失。 研究表明,原核細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)重組人巨細(xì)胞病毒pp65362-504-gB607-621可溶性表達(dá)并且獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白的目標(biāo)尚難實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)pp65362-504-gB607-621融合基因可溶性表達(dá)并且獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)仍需進(jìn)一步探索,為了獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且可溶的目的蛋白質(zhì),可以考慮將目的蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)空間或胞外進(jìn)行目的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)。
[Abstract]:With the increasing development of the study of protein structure and function, to obtain a large number of purified soluble protein became the basis of the study, the prokaryotic expression of exogenous gene is the method to obtain the amount of target protein in the easiest and most economical, but because the prokaryotic system itself does not exist modification after translation characteristics, the purpose of protein expression often the formation of inclusion bodies with no biological activity. Therefore, trying to use different prokaryotic expression system to get soluble and stable target protein is the primary problem to solve in prokaryotic system.
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1345118