本文關(guān)鍵詞：GX50對(duì)與皮膚衰老相關(guān)的NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景目前已有研究證明，尼古丁(即煙堿)可以通過(guò)激活α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nicotin acetylcholine receptor，α7nAChR）來(lái)抑制核因子κB（nuclear transcriptionfator-kappa B，NF-κB）信號(hào)通路，從而預(yù)防老年癡呆癥[1]。但尼古丁會(huì)使人上癮，重復(fù)使用尼古丁會(huì)加快心臟速度和升高血壓并降低食欲。大劑量的尼古丁會(huì)引起惡心嘔吐，嚴(yán)重時(shí)會(huì)致死。由于α7nAChR是尼古丁的主要效應(yīng)部位，魏冬青教授針對(duì)尼古丁發(fā)揮作用的α7nAChR，采用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)并篩選得到一種化合物GX50。GX50是花椒中的一種天然組分，使用安全。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，GX50對(duì)巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路都具有調(diào)節(jié)作用，為了探究它對(duì)皮膚衰老的作用，我們以皮膚為模型，研究GX50對(duì)皮膚衰老及NF-κB信號(hào)通路的作用，為該化合物應(yīng)用于臨床做準(zhǔn)備。有文獻(xiàn)表明哺乳動(dòng)物老化普遍與NF-κB有關(guān)，證明年老皮膚中NF-κB被嚴(yán)重阻斷能逆轉(zhuǎn)許多老化特征[2]。已證實(shí)人類(lèi)和小鼠的許多組織中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可能是與老化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化的活化劑。年齡性衰老小鼠皮膚的NF-κB基因被阻斷，能使整體基因表達(dá)程序逆轉(zhuǎn)到年輕時(shí)的狀態(tài)，在形態(tài)學(xué)上表型也會(huì)恢復(fù)到年輕時(shí)候的狀態(tài)[3]。 目的探究GX50對(duì)皮膚衰老及NF-κB信號(hào)通路的作用，為該化合物應(yīng)用于臨床做準(zhǔn)備。 方法為了探究GX50在皮膚衰老中的作用，我們主要從組織水平和細(xì)胞水平兩方面進(jìn)行研究。在組織水平上，進(jìn)行了涂藥實(shí)驗(yàn)，給老年小鼠背部皮膚左側(cè)涂抹溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和甘油中的GX50，右側(cè)只涂DMSO和甘油做對(duì)照，兩周后剪取兩側(cè)皮膚制作冰凍切片。首先進(jìn)行HE染色，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組皮膚的差別。為進(jìn)一步說(shuō)明兩側(cè)皮膚的區(qū)別，我們選擇膠原蛋白抗體進(jìn)行免疫組化染色，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組膠原蛋白表達(dá)量。 為了探究GX50促使皮膚年輕化的作用靶點(diǎn)是否也是NF-κB信號(hào)通路，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組皮膚進(jìn)行了電泳遷移率分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定NF-κB入核量，來(lái)檢驗(yàn)NF-κB的活性。 使用Western Blot的方法對(duì)皮膚組織漿蛋白進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是NF-κB信號(hào)通路中NF-κB的抑制因子I-κB磷酸化的程度。 在細(xì)胞水平上，進(jìn)行小鼠表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)并選取廣譜角蛋白（PanCytokeratin，PCK）一抗進(jìn)行免疫熒光染色鑒定其純度。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行GX50、脂多糖（lipopolysacharide，LPS）和空白對(duì)照（Blank）處理，然后提取表皮細(xì)胞膜蛋白、核蛋白和漿蛋白，并在紫外分光光度計(jì)下對(duì)所提蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。藥物設(shè)計(jì)方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GX50能有效地激活α7nAChR，應(yīng)用Octet RED生物相互作用分析儀，檢測(cè)GX50與表皮細(xì)胞膜α7nAChR的結(jié)合能力。通過(guò)EMSA來(lái)檢測(cè)表皮細(xì)胞NF-κB的活性。通過(guò)Western Blot來(lái)檢測(cè)IκB磷酸化的程度。 結(jié)果（1）小鼠皮膚組織切片HE染色結(jié)果顯示：表皮部分，左側(cè)比右側(cè)平坦，基底層細(xì)胞大小、形態(tài)較規(guī)整，胞外基質(zhì)排列較緊密；真皮部分，左側(cè)比右側(cè)毛囊多而密，，黑素細(xì)胞數(shù)目較多，黑色素沉積較少；表皮與真皮的交界處，左側(cè)皮膚交界比較明顯，表皮與真皮的連接比較牢固。（2）小鼠皮膚組織切片免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)左側(cè)比右側(cè)的膠原蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。（3）小鼠皮膚組織EMSA結(jié)果顯示涂有GX50的皮膚組織中入核的NF-κB蛋白量比對(duì)照組有所降低（P＜0.05），從而證實(shí)GX50對(duì)NF-κB的活化有一定的抑制作用。(4)小鼠皮膚組織Western Blot結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組上樣量多的情況下，對(duì)照組有隱約的p-IκB的條帶，而涂有GX50的實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有看到條帶。通過(guò)內(nèi)參校正，認(rèn)為GX50可能抑制了I-κB的磷酸化，從而阻遏了NF-κB的活化，使其對(duì)下游靶基因的調(diào)節(jié)減弱。（5）受體結(jié)合曲線(xiàn)趨勢(shì)說(shuō)明GX50對(duì)皮膚調(diào)節(jié)作用的靶點(diǎn)可能就是α7nAChR。（6）EMSA滯后帶灰度分析說(shuō)明表皮細(xì)胞GX50組NF-κB的入核量低于空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明GX50降低了NF-κB的活性。（7）結(jié)果顯示GX50組的細(xì)胞漿蛋白中的IκB高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而GX50組的細(xì)胞漿蛋白中的p-IκB低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明GX50抑制了IκB的磷酸化。 結(jié)論綜合細(xì)胞水平、組織水平上的實(shí)驗(yàn)，可以初步認(rèn)為GX50是通過(guò)α7nAChR來(lái)調(diào)節(jié)與皮膚衰老相關(guān)的NF-κB通路，從而使得皮膚變的年輕化。
[Abstract]:Backgroundrecently studies have shown that nicotine (i.e., nicotine) can activate alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor (7nicotin acetylcholine alpha receptor, alpha 7nAChR) to inhibit nuclear factor kappa B (nuclear transcriptionfator-kappa B, NF- K B) signaling pathway, thereby preventing Alzheimer's disease [1]. But nicotine is addictive, and repeated use of nicotine can speed up heart speed, raise blood pressure and reduce appetite. Large doses of nicotine can cause nausea and vomiting, which can cause death in severe cases. Because alpha 7nAChR is the main effect part of nicotine, Professor Wei Dongqing used the Bioinformatics Method to design and screen a compound GX50, which is nicotine played the role of 7nAChR. GX50 is a natural component of Zanthoxylum. It is safe to use. Our previous study found that GX50 on macrophages, nerve cells and endothelial cells in NF- B signaling pathway has a regulatory role, in order to explore its effect on skin aging, we used the model of GX50 on the skin, skin aging and NF- B pathway for the clinical application of compound do ready. There are some literatures that the aging of mammals is generally associated with NF- kappa B. It is proved that the serious blocking of NF- kappa B in old skin can reverse many aging characteristics of [2]. It has been confirmed that the transcription factor NF- kappa B in many human and mouse tissues may be an activator of aging related transcriptional changes. The NF- kappa B gene in the skin of aging mice is blocked, which can reverse the whole gene expression program to the state of young age. In morphology, the phenotype will also return to the young state [3].
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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