發(fā)布時間：2017-12-21 15:31

  本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒Core蛋白通過MLX調(diào)控肝細胞脂類代謝的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：蛋白質(zhì)組學(xué)是全景式鑒定和定量細胞或組織的蛋白質(zhì),并且系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)功能的新興學(xué)科。隨著液相色譜--質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及生物樣本的化學(xué)標(biāo)記方法的不斷發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)研究已由低覆蓋鑒定轉(zhuǎn)變?yōu)楦吒采w鑒定,由簡單的定性鑒定研究轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔榷垦芯恳殉蔀榈鞍踪|(zhì)組學(xué)研究的大趨勢。由于實驗誤差的存在,基于無標(biāo)定量(LFQ, Label Free Quantitation)和基于肽段層面的化學(xué)標(biāo)記定量(iTRAQ, isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)在定量精度和靈敏度上都難于與基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸的細胞培養(yǎng)定量蛋白質(zhì)組技術(shù)(SILAC, Stable Isotope Labeling with Amino acids in cell Culture)相媲美。正如德國科學(xué)家Mann總結(jié)的,SILAC已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)定量的金標(biāo)準(zhǔn)。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)引起的乙型肝炎是我國第一大傳染疾病。其中,由HBV感染導(dǎo)致患者發(fā)生肝炎、肝硬化和肝癌是感染后疾病發(fā)生、發(fā)展的三個病程。HBV病毒編碼病毒的核心蛋白(HBc, Core protein)在宿主細胞內(nèi)組裝形成病毒核心顆粒,并包裹病毒的半不閉合環(huán)狀DNA。核心顆粒能夠協(xié)調(diào)成熟的HBV病毒基因組DNA轉(zhuǎn)移到宿主細胞的細胞核中,導(dǎo)致HBV能夠持續(xù)的感染肝細胞,但目前科學(xué)家對HBc蛋白在肝病發(fā)生、發(fā)展中的功能和作用機制尚不清楚。本研究通過向肝癌細胞系HepG2細胞轉(zhuǎn)染p3×Flag CMV14/HBc質(zhì)粒,然后使用G418篩選,成功構(gòu)建了能穩(wěn)定表達HBc蛋白的多克隆細胞系和對照組細胞系。我們首先對篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系進行了一系列的細胞表型實驗研究。通過油紅O染色實驗發(fā)現(xiàn)HepG2細胞表達HBc蛋白后,細胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生明顯蓄積。CCK-8細胞增殖活性實驗則表明HBc蛋白存在著促進細胞增殖的功能。細胞劃痕實驗證實HBc穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的遷移能力較對照組明顯提高。HBc細胞的游離膽固醇與對照組沒有差異,但是總膽固醇明顯升高,提示HBc細胞內(nèi)的膽固醇酯類含量比對照組有所升高。本研究利用高覆蓋、高精度正反SILAC標(biāo)記策略,系統(tǒng)地揭示了HBc引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)豐度變化的規(guī)律。將這些定量差異蛋白進行GO (Gene Oncology)分析和功能注釋,發(fā)現(xiàn)其在膽固醇、脂質(zhì)合成與蓄積、糖酵解方面顯著富集,表明HBc通過引發(fā)肝細胞脂肪化促進肝病發(fā)展的分子機制。進一步利用CoIP-LC-MS/MS技術(shù),我們成功地鑒定到了與HBc結(jié)合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MLX。利用ChIP-qPCR技術(shù),我們證實MLX可結(jié)合到這些參與能量代謝的差異蛋白編碼基因上游調(diào)控序列。利用熒光標(biāo)記和顯微技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)HBc蛋白通過與MLX結(jié)合,裹挾MLX蛋白入核,從而增強代謝相關(guān)差異蛋白的轉(zhuǎn)錄水平,并導(dǎo)致肝細胞發(fā)生脂質(zhì)蓄積的分子機制。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.21

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本文編號：1316231