本文關(guān)鍵詞：抗FAT-1蛋白單克隆抗體的制備和鑒定

  更多相關(guān)文章： n-3多不飽和脂肪酸 FAT-1 單克隆抗體 ELISA 免疫組化

【摘要】：目的:n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)是細胞保持正常功能所需的必需脂肪酸,對許多疾病都有預(yù)防和治療作用。來自于秀麗隱桿線蟲的fat-1基因可以將n-6PUFAs轉(zhuǎn)換為n-3PUFAs,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)獲得了一些fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠、豬和牛等。但是目前尚未有針對FAT-1蛋白的抗體,本研究主要是制備針對FAT-1蛋白的單克隆抗體并對其功能進行鑒定。方法:采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)制備重組FAT-1(r FAT-1)蛋白,并用His-trap親和層析柱純化r FAT-1蛋白,然后SDS-PAGE對其純度進行分析,進一步用串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定r FAT-1蛋白。以r FAT-1蛋白免疫小鼠,利用單克隆抗體制備技術(shù)來制備FAT-1單克隆抗體,酶聯(lián)免疫吸附測定分析FAT-1單克隆抗體的亞型和抗體滴度。最后利用免疫印跡和免疫組織化學(xué)法檢測fat-1轉(zhuǎn)基因及野生型小鼠的肝臟、肺臟、腎臟、心臟、腦和脾臟內(nèi)的FAT-1蛋白。結(jié)果:純化后的r FAT-1蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳顯示有一條約46 k Da大小的條帶。串聯(lián)質(zhì)譜對該蛋白測序并檢索數(shù)據(jù)庫得到最佳匹配蛋白為FAT-1蛋白。經(jīng)過雜交瘤細胞篩選和三輪亞克隆后得到最佳目的雜交瘤細胞株,命名為3A11,SDS-PAGE電泳檢查后顯示有兩條約為55 k Da和25 k Da大小的條帶。酶聯(lián)免疫吸附測定分析FAT-1單克隆抗體的亞型為Ig G2a,抗體滴度可達0.05μg/m L。同時,過免疫印跡和免疫組織化學(xué)法,FAT-1單克隆抗體(3A11)成功檢測到FAT-1蛋白在fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟、肺臟、腎臟、心臟、腦和脾臟內(nèi)均有表達,而在野生型C57BL/6對照組的組織中未檢測到FAT-1蛋白。結(jié)論:抗FAT-1單克隆抗體的制備為fat-1轉(zhuǎn)基因哺乳動物體內(nèi)FAT-1蛋白表達的檢測提供了新方法。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：1167840