本文關鍵詞：GRP78重組表達腺病毒的構建及在HepG2細胞的表達及其相關功能研究

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【摘要】：目的:構建葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重組表達腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2細胞建立能夠高表達GRP78的細胞模型,同時在HepG2細胞中研究重組表達GRP78腺病毒對細胞增殖能力的影響。方法:利用腺病毒穿梭質粒pAd Track-TO4構建載有GRP78基因的穿梭質粒pAd Track-TO4-GRP78載體,并通過基因測序鑒定載體序列正確。將載體用PmeⅠ酶切線性化,與Ad Easy-BJ5183感受態(tài)細胞進行基因同源重組。將重組后的腺病毒載體經PacⅠ酶切線性化后,轉染到HEK293細胞中進行包裹,根據(jù)增強綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表達判斷重組腺病毒的包裝情況。通過反復離心和低溫裂解細胞提取GRP78重組表達腺病毒。以人肝癌HepG2細胞為目標,進行病毒感染。通過qRT-PCR檢測GRP78基因表達情況,使用Western blot檢測GRP78蛋白的表達。最后感染HepG2細胞,通過MTS比色法檢測重組表達GRP78腺病毒對細胞增殖的影響。結果:測序驗證pAd Track-TO4-GRP78構建成功,酶切驗證重組腺病毒載體pAd-GRP78構建成功。在HEK293細胞中將pAd-GRP78包裹,GPF熒光檢測結果表示病毒包裝成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2細胞,qRT-PCR檢測到細胞中GRP78基因的過表達,Western blot方法檢測到GRP78蛋白的高表達。MTS檢測結果顯示重組表達GRP78腺病毒對HepG2肝癌細胞有促增殖作用。結論:實驗成功構建了GRP78重組表達腺病毒,并驗證了構建的腺病毒載體可以收集并感染HepG2細胞表達GRP78蛋白。證明了重組表達GRP78腺病毒能夠促進肝癌細胞的增殖。為進一步研究GRP78的功能奠定了基礎。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院;感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室;重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科;
【關鍵詞】： 腺病毒 葡萄糖調節(jié)蛋白 HepG細胞 MTS
【基金】：國家自然科學基金資助項目(編號:81301395)
【分類號】：R373;Q78
【正文快照】： 葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78),是熱休克蛋白70(heat shock proteins,HSPs)家族的成員之一。GRP78作為定位于內質網的結合蛋白,有分子伴侶、維持內質網的穩(wěn)定,保護細胞等多種功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)GRP78在細胞應激時大量表達,降低細胞凋亡,對于慢性心功

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