本文關(guān)鍵詞：GRP78重組表達(dá)腺病毒的構(gòu)建及在HepG2細(xì)胞的表達(dá)及其相關(guān)功能研究

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【摘要】：目的:構(gòu)建葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重組表達(dá)腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2細(xì)胞建立能夠高表達(dá)GRP78的細(xì)胞模型,同時(shí)在HepG2細(xì)胞中研究重組表達(dá)GRP78腺病毒對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。方法:利用腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd Track-TO4構(gòu)建載有GRP78基因的穿梭質(zhì)粒pAd Track-TO4-GRP78載體,并通過基因測(cè)序鑒定載體序列正確。將載體用PmeⅠ酶切線性化,與Ad Easy-BJ5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行基因同源重組。將重組后的腺病毒載體經(jīng)PacⅠ酶切線性化后,轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裹,根據(jù)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表達(dá)判斷重組腺病毒的包裝情況。通過反復(fù)離心和低溫裂解細(xì)胞提取GRP78重組表達(dá)腺病毒。以人肝癌HepG2細(xì)胞為目標(biāo),進(jìn)行病毒感染。通過qRT-PCR檢測(cè)GRP78基因表達(dá)情況,使用Western blot檢測(cè)GRP78蛋白的表達(dá)。最后感染HepG2細(xì)胞,通過MTS比色法檢測(cè)重組表達(dá)GRP78腺病毒對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:測(cè)序驗(yàn)證pAd Track-TO4-GRP78構(gòu)建成功,酶切驗(yàn)證重組腺病毒載體pAd-GRP78構(gòu)建成功。在HEK293細(xì)胞中將pAd-GRP78包裹,GPF熒光檢測(cè)結(jié)果表示病毒包裝成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)到細(xì)胞中GRP78基因的過表達(dá),Western blot方法檢測(cè)到GRP78蛋白的高表達(dá)。MTS檢測(cè)結(jié)果顯示重組表達(dá)GRP78腺病毒對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞有促增殖作用。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了GRP78重組表達(dá)腺病毒,并驗(yàn)證了構(gòu)建的腺病毒載體可以收集并感染HepG2細(xì)胞表達(dá)GRP78蛋白。證明了重組表達(dá)GRP78腺病毒能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步研究GRP78的功能奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院;感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科;
【關(guān)鍵詞】： 腺病毒 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 HepG細(xì)胞 MTS
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81301395)
【分類號(hào)】：R373;Q78
【正文快照】： 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78),是熱休克蛋白70(heat shock proteins,HSPs)家族的成員之一。GRP78作為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合蛋白,有分子伴侶、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定,保護(hù)細(xì)胞等多種功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)GRP78在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)大量表達(dá),降低細(xì)胞凋亡,對(duì)于慢性心功

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本文編號(hào)：1096091