本文關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒抑制劑篩選及環(huán)匹阿尼酸抗病毒機制研究

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是一種常見的引起嬰幼兒急性下呼吸道感染的病原,RSV同時可以感染免疫缺陷人群,器官移植后的病人和老年人,引起高致死率。RSV于1956年在一只黑猩猩鼻炎分泌物中首次發(fā)現(xiàn),第二年有報道顯示RSV可以感染嬰幼兒導致支氣管炎。RSV屬于副粘病毒科,是一種單鏈負鏈RNA病毒�；蚪M15.2 kb,編碼11種蛋白。它分為A,B兩個亞型,每年交替流行出現(xiàn)。每年感染約3千萬兒童,其中發(fā)展中國家受影響最大。在世界范圍內(nèi),還沒有疫苗或有效的抗病毒治療方法。所以亟待研發(fā)有效的抗病毒藥物和疫苗。早期研制的甲醛滅活疫苗不但不能提供足夠的保護,而且出現(xiàn)了免疫增強引起的疾病,甚至導致了嬰兒死亡。目前唯一獲得批準的治療藥物是利巴韋林(ribavirin),但是由于它存在有效性有待確定,毒性較大等原因僅被用于高危患兒。雖然一種人單克隆抗體帕麗珠單抗(Palivizumab)已經(jīng)獲得批準,由于費用昂貴等問題難以廣泛應(yīng)用。為了尋找新的抑制RSV的小分子化合物,我們建立了一種基于檢測病毒引起細胞病變(Cytopathic Effect,CPE)的高通量篩選方法。我們的篩選方法是基于呼吸道合胞病毒感染細胞后會引起細胞融合形成大量合胞體導致細胞死亡,加入抑制劑將會有效抑制這一過程的原理。在感染前加入化合物,與病毒共培養(yǎng)4天后通過熒光試劑檢測化合物抑制細胞病變效果。該方法可靠高效,可以篩選到抑制病毒生活史各時期的化合物。經(jīng)過優(yōu)化篩選條件,我們最終確定了篩選條件,在96孔板中每孔鋪入5000個HEp-2細胞,培養(yǎng)24 h后加入稀釋到終濃度為2.5μg/ml的化合物,加入藥物混勻后10分鐘加入感染復數(shù)MOI=0.5的病毒溶液,培養(yǎng)96 h后通過測細胞活性的方式檢測化合物抑制病毒效果。通過篩選含有502個天然化合物的藥物庫,我們找到7個抑制率大于40%的天然化合物,用于進一步驗證。其中環(huán)匹阿尼酸(Cyclopiazonic acid,CPA)效果最佳,我們深入研究了它的抗病毒機制。環(huán)匹阿尼酸是一種特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑,在低毒性濃度強烈抑制RSV復制。我們測得EC50為4.2μM,CC50為33.9μM,SI 8.2。通過細胞病變檢測和病毒產(chǎn)量減少實驗兩種體外實驗驗證了環(huán)匹阿尼酸(CPA)對呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制效果。CPA抑制RSV A和B病毒株復制,同時它抑制人類副流感病毒(PIV-3),但并不抑制腸病毒71型(EVA-71)。通過定點加藥實驗研究CPA的作用機理,發(fā)現(xiàn)CPA在感染0-8 h抑制病毒復制或轉(zhuǎn)錄過程。通過小基因組檢測(minigenome assay)實驗驗證了CPA在病毒基因組復制的過程中起作用。另外合胞形成實驗顯示CPA抑制RSV合胞形成。我們進一步研究了它的抗病毒機制,我們檢測了另外兩個鈣ATP酶抑制劑(Thapsigargin,TG和BHQ)對于病毒復制的作用,我們發(fā)現(xiàn)這兩種細胞內(nèi)鈣泵抑制劑抑制病毒復制,其中10 nm TG可以使病毒效價降低124.5倍。我們推測由于鈣泵引起細胞溶質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高抑制了病毒復制過程。進而我們研究了兩種鈣離子載體(A23187,Ionomycin)以及一種Na+/K+-ATP酶均表現(xiàn)出病毒復制抑制作用。而通過抑制細胞膜表面的鈣離子通降低細胞內(nèi)鈣離子濃度(Nifedipine、Nimodipine和Tetrandrine)并不能抑制病毒復制。因此,我們的研究結(jié)果表明細胞內(nèi)鈣濃度的增加對于RSV復制有抑制效果,提示一種新的RSV治療。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道合胞病毒 高通量篩選 天然產(chǎn)物 環(huán)匹阿尼酸 細胞質(zhì)鈣離子濃度
【學位授予單位】：上海大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.14
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 緒論13-24
• 1.1 呼吸道合胞病毒的生物學特性13-15
• 1.1.1 呼吸道合胞病毒形態(tài)多樣性13
• 1.1.2 呼吸道合胞病毒基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能13-15
• 1.1.3 呼吸道合胞病毒受體15
• 1.2 呼吸道合胞病毒流行病學特征15-16
• 1.3 呼吸道合胞病毒免疫反應(yīng)及發(fā)病機制16-18
• 1.4 抗病毒機制研究及藥物、疫苗研究進展18-21
• 1.4.1 抗病毒藥物研究進展18-19
• 1.4.2 其他抗病毒機制研究19-20
• 1.4.3 抗呼吸道合胞病毒疫苗20-21
• 1.5 課題研究的目的和意義21-22
• 1.6 國內(nèi)外研究概況22-24
• 1.6.1 國內(nèi)研究狀況22-23
• 1.6.2 國外研究狀況23-24
• 第二章 實驗材料與方法24-35
• 2.1 實驗材料24-27
• 2.1.1 細胞系及病毒株24
• 2.1.2 化合物24-25
• 2.1.3 溶液25
• 2.1.4 試劑耗材25-27
• 2.1.5 實驗儀器27
• 2.2 實驗方法27-35
• 2.2.1 細胞及病毒培養(yǎng)27-28
• 2.2.2 高通量篩選條件的確定28-29
• 2.2.3 高通量藥物篩選29
• 2.2.4 劑量依賴細胞病變驗證實驗29-30
• 2.2.5 細胞毒性實驗30
• 2.2.6 空斑實驗測定病毒滴度30-31
• 2.2.7 呼吸道合胞病毒生長曲線測定31-32
• 2.2.8 病毒產(chǎn)量減少實驗32
• 2.2.9 定點加藥實驗32
• 2.2.10 小基因組檢測32-33
• 2.2.11 合胞形成實驗33
• 2.2.12 數(shù)據(jù)處理33-35
• 第三章 實驗結(jié)果35-50
• 3.1 基于細胞病變檢測的高通量藥物篩選35-39
• 3.1.1 篩選條件優(yōu)化35-37
• 3.1.2 篩選條件的驗證37
• 3.1.3 天然化合物庫篩選37-38
• 3.1.4 初篩化合物驗證38-39
• 3.2 環(huán)匹阿尼酸抗病毒作用39-43
• 3.2.1 環(huán)匹阿尼酸對于呼吸道合胞病毒抑制作用39-42
• 3.2.2 環(huán)匹阿尼酸對于副流感病毒及腸道病毒作用42-43
• 3.3 環(huán)匹阿尼酸抗病毒機制研究43-50
• 3.3.1 環(huán)匹阿尼酸抑制呼吸道合胞病毒復制或轉(zhuǎn)錄過程43-44
• 3.3.2 環(huán)匹阿尼酸抑制呼吸道合胞病毒復制作并不是由于抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵引起44-46
• 3.3.3 提高細胞質(zhì)內(nèi)Ca~(2+)濃度抑制呼吸道合胞病毒復制46
• 3.3.4 抑制細胞膜離子通道并不能抑制病毒復制46-48
• 3.3.5 增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵活力能緩解對呼吸道合胞病毒抑制48-50
• 第四章 討論與展望50-53
• 參考文獻53-59
• 發(fā)表文章及專利59-60
• 致謝60-61

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 程曄;呼吸道合胞病毒研究有新發(fā)現(xiàn)[J];醫(yī)學信息;1997年09期

2 ;呼吸道合胞病毒的分離及其生物性狀的研究[J];微生物學報;1975年02期

3 洪陶;;呼吸道合胞病毒株在流行周期中發(fā)生變異的一些規(guī)律[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1983年06期

4 張伊璜;;小鼠呼吸道合胞病毒的感染[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1984年04期

5 胡伯淵,紀耀沅;嬰兒肺炎呼吸道合胞病毒的分離鑒定[J];江蘇醫(yī)藥;1982年05期

6 楊佩珍;;老年監(jiān)護病房中的一次呼吸道合胞病毒暴發(fā)流行[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);1986年04期

7 閔靜娟;王之梁;;呼吸道合胞病毒研究進展[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1987年05期

8 段佩若,張力力,韓洪彥;呼吸道合胞病毒單克隆抗體用于紙上橋聯(lián)酶標診斷的初步探討[J];細胞與分子免疫學雜志;1990年03期

9 段佩若,張勵力,韓洪彥,常汝虛,謝建平,周天棟,李冬,于國慧,徐文華;呼吸道合胞病毒單克隆抗體用于紙上橋聯(lián)酶標診斷的初步探討[J];細胞與分子免疫學雜志;1991年01期

10 許國英;趙惠芬;龔明敏;閻田玉;;活血化瘀為主治療呼吸道合胞病毒肺炎[J];中醫(yī)雜志;1991年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙曉東;;呼吸道合胞病毒單抗逃逸株適合度評價[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

2 吳苔;孫偉;汪潔;陳理華;;新生兒呼吸道合胞病毒肺炎48例臨床分析[A];2007年浙江省兒科學、小兒外科學學術(shù)年會論文匯編[C];2007年

3 丁國標;;住院患兒急性下呼吸道感染病原學調(diào)查[A];中華醫(yī)學會第十三屆全國兒科呼吸學術(shù)會議論文匯編[C];2012年

4 趙惠芬;李莉;韓瑞珠;;567例呼吸道合胞病毒肺炎的臨床研究[A];全國中西醫(yī)結(jié)合兒科第十次學術(shù)會議論文集[C];2002年

5 鄭曉群;陳小芳;林虹;張信良;呂建新;;實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速鑒別呼吸道合胞病毒亞型[A];浙江省生物化學與分子生物學學術(shù)交流會論文集[C];2005年

6 趙曉東;;肝素阻斷呼吸道合胞病毒與氣道上皮細胞黏附[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

7 劉玉華;侯安存;趙高潮;王鳳蓮;烏珊娜;;中西藥聯(lián)合應(yīng)用對呼吸道合胞病毒抑制作用的研究[A];第五次全國中西醫(yī)結(jié)合中青年學術(shù)研討會論文匯編[C];2004年

8 林新;王建平;熊廣;余然;高雪;曲敬來;;呼吸道合胞病毒與成人支氣管哮喘急性發(fā)作的相關(guān)性研究[A];2006年全國危重病急救醫(yī)學學術(shù)會議論文集[C];2006年

9 梁園;陳尚勤;;新生兒呼吸道合胞病毒肺炎的臨床特點[A];2011年浙江省醫(yī)學會兒科學分會學術(shù)年會暨兒內(nèi)科疾病診治新進展國家級學習班論文匯編[C];2011年

10 錢月芳;高蘭平;湯華平;顧曉玲;馬澤南;莫建青;;呼吸道合胞病毒與嬰幼兒早期喘息的相關(guān)分析[A];2012年江浙滬兒科學術(shù)年會暨浙江省醫(yī)學會兒科學分會學術(shù)年會、兒內(nèi)科疾病診治新進展國家級學習班論文匯編[C];2012年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 編譯 李勇;呼吸道合胞病毒新藥研發(fā)求破局[N];中國醫(yī)藥報;2012年

2 邵建國;帕利珠單抗打響保衛(wèi)戰(zhàn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2010年

3 言鳳鳴;呼吸道合胞病毒易引發(fā)兒童感冒和肺炎[N];衛(wèi)生與生活報;2008年

4 伊遙;抗呼吸道合胞病毒感染“真空”待補[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2012年

5 張見麟;小心呼吸道合胞病毒隨冷空氣而至[N];健康報;2003年

6 記者 李曉;4年追蹤揪出兒童感冒“元兇”[N];蘇州日報;2010年

7 ;幾種呼吸道病毒性疾病表現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2006年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 谷宏婧;呼吸道合胞病毒的病毒樣顆粒疫苗制備及其感染導致肺損傷機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2015年

2 馮凱;流感病毒與呼吸道合胞病毒雙重感染BALB/c小鼠的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

3 鄭林玲;量子點標記的呼吸道合胞病毒活細胞內(nèi)動態(tài)輸運途徑示蹤分析[D];西南大學;2014年

4 劉曉鳴;呼吸道合胞病毒致大鼠腎病多種損傷機制研究[D];四川大學;2006年

5 蔣雄斌;CD8～+T細胞在呼吸道合胞病毒誘導的哮喘中的作用研究[D];南京醫(yī)科大學;2006年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金婷婷;Chemerin在嬰幼兒呼吸道合胞病毒肺炎中的意義[D];復旦大學;2013年

2 劉沁;呼吸道合胞病毒載量與急性下呼吸道感染病情嚴重程度的相關(guān)性[D];南華大學;2015年

3 劉太香;呼吸道合胞病毒感染調(diào)控NLRC5表達及其意義[D];南京大學;2014年

4 沈黎;金蟬口服液治療小兒呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎的有效性與安全性臨床研究[D];蘇州大學;2016年

5 崔睿;呼吸道合胞病毒抑制劑篩選及環(huán)匹阿尼酸抗病毒機制研究[D];上海大學;2016年

6 豐達星;河南省呼吸道合胞病毒分子生物學研究[D];鄭州大學;2008年

7 熊鷹;武漢地區(qū)兒童感染呼吸道合胞病毒的分子流行病學研究[D];華中師范大學;2011年

8 秦弦;重慶地區(qū)呼吸道合胞病毒F和G基因變異分析（2009年-2011年）[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

9 王瑞博;呼吸道合胞病毒重組融合蛋白TB10.4-F1免疫原性和安全性的研究[D];昆明理工大學;2011年

10 夏秋玲;呼吸道合胞病毒分離培養(yǎng)及其F蛋白基因變異分析[D];重慶醫(yī)科大學;2013年

，

本文編號：1021540