本文關(guān)鍵詞：SREBP-2誘導(dǎo)肝細(xì)胞成脂的研究

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【摘要】：肝臟是人們體內(nèi)以代謝功能為主的重要的生命器官,在體內(nèi)發(fā)揮著去毒素、糖原儲(chǔ)存以及分泌、蛋白質(zhì)合成等重要作用,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)代謝紊亂就會(huì)產(chǎn)生諸多疾病(如非酒精性脂肪肝等)。肝脂代謝是一個(gè)復(fù)雜的多因子參與共同調(diào)控的在機(jī)體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡的過程,SREBPs家族為現(xiàn)階段公認(rèn)的調(diào)節(jié)脂類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在脂肪酸、膽固醇等脂類物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用,SREBP-2是該家族成員之一,在脂類物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,然而具體調(diào)節(jié)機(jī)制還不甚明了。為深入研究SREBP-2調(diào)節(jié)肝脂代謝過程與分子機(jī)制,本文首先以成年小鼠為肝細(xì)胞供體,用酶消化法分離獲得肝原代細(xì)胞,并進(jìn)行原代與傳代培養(yǎng);然后對分離的肝細(xì)胞用形態(tài)觀察法與過碘酸-雪夫法初步鑒定,確定分離的原代細(xì)胞為肝細(xì)胞。最后用介導(dǎo)SREBP-2過表達(dá)的腺病毒侵染肝細(xì)胞,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測肝細(xì)胞中SREBP-2,C/EBPα,FAS和SREBP-1c四個(gè)基因的相對表達(dá)量,分析SREBP-2調(diào)節(jié)肝脂代謝的分子機(jī)制。得到如下結(jié)果:(1)應(yīng)用“酶消化法”成功分離得到了高產(chǎn)量與高成活率的原代肝細(xì)胞,過碘酸-雪夫反應(yīng)鑒定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被染成紅色,并且形態(tài)均一,說明細(xì)胞內(nèi)含有大量的肝糖原,進(jìn)一步說明分離的肝細(xì)胞純度較高;(2)熒光定量結(jié)果顯示Ad-SREBP-2腺病毒能夠介導(dǎo)SREBP-2基因在原代肝細(xì)胞中過表達(dá),且表達(dá)量提高80倍以上;(3)油紅O染色觀察顯示SREBP-2過表達(dá)后能夠促進(jìn)肝細(xì)胞脂滴的合成與沉積;(4)SREBP-2過表達(dá)對脂肪酸合成酶(FAS)與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP-1)基因的表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用,而對轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPα)基因的表達(dá)沒有顯著影響。綜上,本研究分離得到了大量的原代肝細(xì)胞并進(jìn)行了鑒定,并且SREBP-2過表達(dá)后能夠顯著促進(jìn)胞內(nèi)脂類沉積與脂類合成相關(guān)基因的高表達(dá),說明SREBP-2在肝細(xì)胞脂質(zhì)合成過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,可能是肝脂代謝紊亂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
【關(guān)鍵詞】：I肝細(xì)胞 肝細(xì)胞的培養(yǎng) 實(shí)時(shí)定量 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R33
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-24
• 1.1 肝細(xì)胞的分離11-13
• 1.1.1 非酶消化法12
• 1.1.2 酶消化法12-13
• 1.2 肝細(xì)胞的培養(yǎng)13-16
• 1.2.1 肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)及方法13-15
• 1.2.2 肝細(xì)胞的傳代培養(yǎng)15-16
• 1.3 肝細(xì)胞的鑒定16-17
• 1.4 SREBPs基因的研究17-21
• 1.4.1 SREBPs簡介17-18
• 1.4.2 SREBPs前體裂解18-19
• 1.4.3 SREBPs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控19-21
• 1.5 脂肪代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與限速酶基因介紹21-22
• 1.5.1 C/EBPα核轉(zhuǎn)錄因子21-22
• 1.5.2 FAS22
• 1.6 研究的目的和意義22-23
• 1.7 研究內(nèi)容23-24
• 第二章 肝細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及SREBP-2 誘導(dǎo)成脂的研究24-34
• 2.1 材料與方法25-26
• 2.1.1 動(dòng)物肝臟組織25
• 2.1.2 主要試劑25
• 2.1.3 主要耗材25
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.1.5 試驗(yàn)試劑的配制26
• 2.2 實(shí)時(shí)定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成26
• 2.3 肝細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定26-29
• 2.3.1 肝細(xì)胞分離26-27
• 2.3.2 肝細(xì)胞原代培養(yǎng)27
• 2.3.3 傳代培養(yǎng)27-28
• 2.3.4 過碘酸-雪夫反應(yīng)鑒定肝細(xì)胞28-29
• 2.4 介導(dǎo)小鼠SREBP-2 過表達(dá)腺病毒的擴(kuò)繁29
• 2.5 病毒滴度測定29
• 2.6 最佳感染復(fù)數(shù)的測定29-30
• 2.7 肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)與病毒侵染30
• 2.8 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄30-31
• 2.9 油紅-O染色觀察31-32
• 2.10 SREBP-2 等基因的定量分析32-34
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析34-46
• 3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)34
• 3.2 肝細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定34-39
• 3.2.1 肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)34-37
• 3.2.2 肝細(xì)胞的傳代培養(yǎng)37-38
• 3.2.3 過碘酸 -雪夫反應(yīng)（PAS）鑒定肝細(xì)胞38-39
• 3.3 病毒滴度測定與MOI值測定39
• 3.4 Ad-SREBP-2 與Ad-CMV病毒侵染細(xì)胞39-40
• 3.5 侵染病毒的肝細(xì)胞油紅-O染色40-42
• 3.6 總RNA的提取與基因定量42-46
• 3.6.1 肝細(xì)胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄42
• 3.6.2 SREBP2基因過表達(dá)檢測42-43
• 3.6.3 脂代謝相關(guān)基因表達(dá)檢測43-46
• 第四章 結(jié)果討論與結(jié)論46-54
• 4.1 肝細(xì)胞的分離純化46-47
• 4.2 肝細(xì)胞的培養(yǎng)47
• 4.3 肝細(xì)胞的鑒定47-48
• 4.4 Ad-SREBP-2 腺病毒侵染肝細(xì)胞48-50
• 4.4.1 介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞48-49
• 4.4.2 Ad Easy腺病毒載體系統(tǒng)49
• 4.4.3 病毒滴度和MOI值測定49-50
• 4.4.4 Ad-SREBP-2 病毒侵染肝細(xì)胞50
• 4.5 總RNA的提取50
• 4.6 SREBP-2 基因?qū)Ω渭?xì)胞脂滴沉積的影響50-51
• 4.7 SREBP-2 對FAS、C/EBPα和SREBP-1c的調(diào)控作用51-53
• 4.7.1 SREBP-2 與SREBP-1c家族內(nèi)相互調(diào)控作用51
• 4.7.2 SREBP-2 調(diào)節(jié)FAS轉(zhuǎn)錄表達(dá)51-52
• 4.7.3 SREBP-2 調(diào)節(jié)C/EBPα轉(zhuǎn)錄表達(dá)52-53
• 4.8 結(jié)果與結(jié)論53-54
• 附錄54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1003883