第 1 章 前言

1.1 研究背景
親水膠體通常是指具有良好的親水性的大分子物質(zhì)，該類分子能充分溶解于水，形成透明、滑膩、粘稠、類似膠狀的物質(zhì)，可有效改善食品體系的質(zhì)地、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[1,2]。親水膠體在自然界分布廣泛，主要分為蛋白和多糖兩大類，其中多糖占絕大多數(shù)，如植物多糖、動物多糖、微生物多糖及改性多糖分子[2,3]。多糖是親水膠體的重要組成部分，植物莖塊、果實的分泌物和提取物（如海藻酸鈉），一些微生物的代謝產(chǎn)物（如黃原膠），以及天然大分子化學(xué)改性后的產(chǎn)物（如變性淀粉）[1,2]都屬于親水膠體。親水膠體具有良好的乳化性、增稠性、持水性和穩(wěn)定性，不僅在化妝品、食品、紡織印染等傳統(tǒng)工業(yè)得到廣泛應(yīng)用，還被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、制藥、環(huán)境治理和生物技術(shù)等新興技術(shù)領(lǐng)域。隨著生活水平的提高，人們逐漸認(rèn)識到了健康食品的重要性，高纖維、低脂肪的新型食品越來越多地受到人們的青睞。大量研究表明，親水膠體可以作為一種可溶性膳食纖維降低人體內(nèi)血清膽固醇的含量，緩解糖尿病人的癥狀等。親水膠體作為脂肪替代品在食品中的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛，全世界每年的產(chǎn)值大概在44億美元，并且還在不斷地增加中[3]。

海藻酸鈉和果膠是重要的親水膠體，由于它們具有良好的凝膠性能和廣泛的應(yīng)用前景，學(xué)者們對其研究從未間斷。海藻酸鈉作為可食用但幾乎不被人體消化吸收的高分子多糖，能夠降低血清和肝臟中的膽固醇，它在胃腸道中具有吸收重金屬離子，凝膠過濾等作用，有助于清除體內(nèi)的重金屬離子[4]。果膠是一種非淀粉多糖的水溶性膳食纖維，具有無毒、可生物降解、來源廣泛等優(yōu)點，已被廣泛用作膠凝劑、增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑等[5]。

1.2 海藻酸鈉概論
海藻酸鈉是褐藻結(jié)構(gòu)的組成成分和土壤中細(xì)菌的莢膜多糖，在自然界中含量十分豐富，全世界每年的產(chǎn)量大概為 3 萬噸，其中有 30%用于食品工業(yè)，剩下的用于其它工業(yè)[6]。我國有著豐富的海洋資源，褐藻的加工產(chǎn)量名列世界前茅，但是在褐藻的深加工方面卻落后于其它國家，因此我國已把褐藻精深加工技術(shù)，特別是海藻酸鈉的精加工及其應(yīng)用研究列入海洋領(lǐng)域的 863 研究和規(guī)劃中。海藻酸鈉除了應(yīng)用于傳統(tǒng)的食品、紡織等輕工業(yè)，還由于其顯著的抗癌、抗氧化、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫、降低血糖等功能，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥等行業(yè)[7~10]。
1.2.1 海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

海藻酸鈉是一種碳水化合物，是由直鏈型（1→4）鍵合的 β-D-甘露糖醛酸（Mannuronic acid，M）與 α-L-古洛糖醛酸（Guluronic acid，G）形成的共聚物[11]。1964-1966 年，Haug[12~14]等人第一次提出了海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)，他們采用水解和分離的方法把海藻酸鈉分為三種完全不同的組分，其中兩種分別是由聚古洛糖醛酸（M）和聚甘露糖醛酸（G）組成，另外一部分是由大量 MG 二聚體組成。他們認(rèn)為海藻酸鈉是由 M 嵌段和 G 嵌段共聚形成的。后人在他們的基礎(chǔ)之上做了大量的研究，對海藻酸鈉的分子結(jié)構(gòu)有了十分詳細(xì)的認(rèn)識，其結(jié)構(gòu)圖如圖 1-1 所示[6]：

1.2.2 海藻酸鈉的研究現(xiàn)狀
目前仍有不少學(xué)者不斷地研究海藻酸鈉與陽離子的絡(luò)合機(jī)理和凝膠化行為。挪威生物高分子實驗室NOBIPOL的Draget和Stokke等人利用小角度X射線散射和流變學(xué)研究了海藻酸鈉與Ca2+的絡(luò)合機(jī)理、凝膠行為以及凝膠結(jié)構(gòu)與性質(zhì)之間的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)在Ca2+濃度較低時，分子主要形成“蛋盒”模型二聚體，在Ca2+濃度較高時，會生成大量橫向交聯(lián)的多聚體[20,21]。同時他們在海藻酸鈉、G嵌段與鈣離子的混合凝膠研究中發(fā)現(xiàn)，在相同的鈣離子濃度條件下，其凝膠強(qiáng)度要小于海藻酸鈉與鈣離子的絡(luò)合。這是由于短鏈的G嵌段會在鈣離子的作用下與海藻酸鈉中的G嵌段絡(luò)合，這種結(jié)合不會增加其凝膠強(qiáng)度，但由于一部分的鈣離子被G嵌段占據(jù)，導(dǎo)致與海藻酸鈉絡(luò)合的鈣離子減少，從而使凝膠強(qiáng)度減弱[22]。
Trieste 大學(xué)的 Donati 等人[23]利用酶對海藻酸鈉進(jìn)行定向酶解，制得不同精細(xì)結(jié)構(gòu)（G/M 比率、嵌段信息）的海藻酸鈉，并以此研究了二價金屬離子與不同嵌段結(jié)構(gòu)的絡(luò)合行為。結(jié)果表明：Ba2+可以與 G 嵌段和 M 嵌段絡(luò)合，Ca2+可以與 G嵌段和 MG 嵌段絡(luò)合，而 Sr2+只能絡(luò)合 G 嵌段。Donati 等人[24]還利用熒光標(biāo)記和圓二色譜等手段對海藻酸鈉最初形成的單體復(fù)合物進(jìn)行了研究，提出了一種傾斜的“蛋盒”模型。他們認(rèn)為“蛋盒”模型并不只是在第二步驟中形成，而在第一步驟中會形成一種傾斜的“蛋盒”模型，但是這種“蛋盒”模型并不穩(wěn)定。
Funami[86]對海藻酸鈉與鈣離子溶液凝膠性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在鈣離子存在下，海藻酸鈉的微凝膠性質(zhì)是由結(jié)構(gòu)一致性或分子組裝后的機(jī)械強(qiáng)度控制的。盡管有文獻(xiàn)報道，海藻酸鈉中 G 單元是其形成離子凝膠的重要組成部分，大量結(jié)合的鈣離子并不是體系粘彈性較好的因素，表明 G 單元中蛋盒模型二聚體并不是影響凝膠的唯一因素，海藻酸鈉的嵌段信息和鈣離子是影響其凝膠方式的重要因素。

此外，國內(nèi)的學(xué)者也對海藻酸鈉進(jìn)行了大量研究。華南理工大學(xué)的童真教授[25]研究了不同分子量、分子量分布和 M/G 比值的海藻酸鈉樣品在不同濃度下的動態(tài)粘彈性，結(jié)果表明，海藻酸鈉水溶液的凝膠轉(zhuǎn)變過程遵循 Winter 方程，凝膠結(jié)構(gòu)具有自相似性，凝膠化點處的凝膠交聯(lián)結(jié)構(gòu)與海藻酸鈉的分子量有關(guān)，短分子鏈海藻酸鈉交聯(lián)的交聯(lián)點比長分子量鏈要少，對彈性的貢獻(xiàn)少。同時，他們[25]也研究了鈣離子、銅離子與不同分子量的海藻酸鈉的臨界凝膠行為，得出了分子量小的海藻酸鈉與鈣離子、銅離子絡(luò)合的臨界指數(shù)符合逾滲模型的預(yù)測值，與海藻酸鈉濃度無關(guān)，屬于生長型凝膠化；而分子量大的海藻酸鈉的臨界指數(shù)與逾滲模型的預(yù)測不一致，屬于交聯(lián)型凝膠化。清華大學(xué)的馮慶玲等人[26]研究出一種特殊的方法使無機(jī)離子和有機(jī)添加劑緩慢且持續(xù)結(jié)合，用來模擬有機(jī)物的生物礦化作用。他們用掃描電鏡（SEM）和 X 射線衍射（XRD）來研究海藻酸鈉對碳酸鈣晶體形成的影響。發(fā)現(xiàn)單個碳酸鈣晶體和球型碳酸鈣聚集體是方解石主要兩種形態(tài)，晶體的大小、形態(tài)和表面粗糙度是由海藻酸鈉中 G 嵌段的長度來決定的。傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（FTIR）和熱重分析儀（TGA）揭示了礦化作用過程中礦物和生物大分子之間的相互作用，在海藻酸鈉和礦物之間有著化學(xué)相互作用，這些作用可能是海藻酸鈉的羧基和礦物中的鈣離子發(fā)生的。同時提出了一種海藻酸鈣水凝膠對碳酸鈣晶體形成的抑制機(jī)理。高 G 含量和低 G 含量的海藻酸鈣水凝膠分別誘導(dǎo)形成雙球性晶體結(jié)晶聚集體和單球性晶體聚集體。從而實現(xiàn)了對碳酸鈣晶體的晶體形狀，尺寸大小和形貌的控制。

第 2 章 海藻酸鈉的分子表征

2.1 引言

本章利用凝膠滲透色譜-多角度激光光散射儀（GPC-MALLS）測定海藻酸鈉分子量及分子量分布，利用粘度法測量海藻酸鈉的固有粘度，利用核磁共振波譜儀（NMR）來測定海藻酸鈉的古洛糖醛酸（G）、甘露糖醛酸（M）的含量及嵌段信息，從而得到海藻酸鈉的精確分子信息。

2.2 實驗材料與儀器設(shè)備
流動相配制：用超純水配制濃度為 0.1 M 的 NaCl 水溶液，向其添加 0.03%（w/w）NaN3以防止微生物的生長。然后用真空泵抽濾三次，微孔濾膜直徑為 0.22μm。置于超聲機(jī)中超聲除去氣泡后作流動相備用。
海藻酸鈉樣品配制：準(zhǔn)確稱取一定量的海藻酸鈉溶于流動相中，使海藻酸鈉溶液終濃度為 0.5 mg/ mL，置于滾軸混合器上過夜搖勻備用。
GPC-MALLS分析系統(tǒng)由Shodex OHpak SB-G型保護(hù)柱、Shodex OHpak SB-805型分離柱、Waters 515 HPLC 型泵和檢測器組成。檢測器由 DAWN HELEOS 型多角度激光光散射儀（激光波長 658 nm）、SPD-10Avp 型紫外檢測器（檢測波長 214nm）和 Optilab rEX 型示差折光檢測器（激光波長 658 nm）組成。進(jìn)樣前樣品用0.45 μm的尼龍濾膜過濾，進(jìn)樣量為200 μL，流速為0.5 mL/ min，實驗溫度為25 ℃。海藻酸鈉的 dn/dc 值為 0.150 mL/g[67]。
從圖 2-1 中可以看出，三種海藻酸鈉的 RI 和 UV 信號顯示出兩個信號峰，峰尖位置分別在 8 mL 和 12 mL 附近，而 LS 只有一個峰，峰尖位置在 8 mL 附近。在洗脫體積為 8 mL 時，LS 與 RI 都有很強(qiáng)的信號，而 UV 信號值很小，表示此物質(zhì)含量多，分子量較大，蛋白含量很小，此物質(zhì)應(yīng)為海藻酸鈉；在洗脫體積為 12 mL時，UV 有很強(qiáng)的信號，而 RI 信號值很小，LS 基本無信號，表示此處物質(zhì)含量少，分子量較小，此物質(zhì)可能為其它小分子物質(zhì)。由圖 2-1 可知三種海藻酸鈉的成分很接近。
由于海藻酸鈉的凝膠性能主要取決于古洛糖醛酸（G）的含量，由表 2-3 可知DMB樣品的G單元含量為67.6%，遠(yuǎn)大于DM樣品和Sigma樣品的35.8%和33.6%。表明 DMB 樣品與陽離子絡(luò)合能力要遠(yuǎn)大于 DM 樣品和 Sigma 樣品。海藻酸鈉與陽離子形成離子凝膠時，G 嵌段的平均長度決定了海藻酸鈉離子凝膠的強(qiáng)度[72]，DMB樣品的G嵌段平均長度為22.0，遠(yuǎn)大于DM樣品和Sigma樣品的4.26和3.12，可能 DMB 樣品的凝膠性能要大于 DM 樣品和 Sigma 樣品。

圖 3-1 是三種海藻酸鈉與鈣離子絡(luò)合時歸一化相對粘度的變化。由圖 3-1（a）可以看出，當(dāng) DM 濃度為 0.025%時，隨著 R 值的增加，歸一化相對粘度基本保持不變，這可能是因為 DM 濃度太低，絡(luò)合反應(yīng)不明顯；當(dāng) DM 濃度為 0.030%、0.040%和 0.050%時，歸一化相對粘度隨著 R 值的增加呈現(xiàn)出先下降后升高再下降的趨勢，絡(luò)合反應(yīng)呈現(xiàn)出三步驟，分子尺寸呈現(xiàn)出先減小后增大再減小的趨勢；當(dāng) DM 濃度為 0.075%和 0.100%時，此時由于 DM 濃度較大，會形成微凝膠，堵塞烏氏粘度計的毛細(xì)管，影響實驗的進(jìn)一步進(jìn)行，此時歸一化相對粘度呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢。由圖 3-2（b）可知可以看出，當(dāng) DMB 濃度為 0.025%、0.030%、0.040%和 0.050%時，歸一化相對粘度隨著 R 值的增加呈現(xiàn)出先下降后升高再下降的趨勢，絡(luò)合反應(yīng)呈現(xiàn)出三步驟，分子尺寸呈現(xiàn)出先減小后增大再減小的趨勢；當(dāng) DMB 濃度為 0.075%和 0.100%時，此時由于 DMB 濃度較大，會形成微凝膠，，堵塞烏氏粘度計的毛細(xì)管，影響實驗的進(jìn)一步進(jìn)行，此時歸一化相對粘度呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢。由圖 3-1（c）可知，當(dāng) Sigma 濃度為 0.025%和 0.030%時，隨著 R 值的增加，歸一化相對粘度基本保持不變，這可能是因為 Sigma 濃度太低，絡(luò)合反應(yīng)不明顯；當(dāng) Sigma 濃度為 0.040%和 0.050%時，歸一化相對粘度隨著 R 值的增加呈現(xiàn)出先下降后升高再下降的趨勢，絡(luò)合反應(yīng)呈現(xiàn)出三步驟，分子尺寸呈現(xiàn)出先減小后增大再減小的趨勢；當(dāng) Sigma 濃度為 0.075%和 0.100%時，此時由于 Sigma 濃度較大，會形成微凝膠，堵塞烏氏粘度計的毛細(xì)管，影響實驗的進(jìn)一步進(jìn)行，此時歸一化相對粘度呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢。

第 3 章 海藻酸鈉與堿土金屬離子的絡(luò)合機(jī)理......................23
3.1 引言.....................................................23
3.2 實驗材料與儀器設(shè)備.......................................23
3.2.1 材料與試劑..............................................23
第 4 章 海藻酸鈉與堿土金屬離子的臨界凝膠行為..................39
4.1 引言.....................................................39
4.2 實驗材料與儀器設(shè)備.....................................39
4.2.1 材料與試劑..............................................39
第 5 章 混合“蛋盒”模型可能性的探究.........................52

5.1 引言...................................................52

第 5 章 混合“蛋盒”模型可能性的探究

5.1 引言
果膠主要由半乳糖醛酸和一些中性多糖組成，分為“光滑區(qū)”和“毛發(fā)區(qū)”[37]，鈣離子絡(luò)合的結(jié)合位點主要集中在光滑區(qū)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究表明，低酯果膠與鈣離子之間也能形成“蛋盒”模型，但是這種“蛋盒”模型與海藻酸鈉和鈣離子形成的“蛋盒”模型有所區(qū)別，通常稱之為被修飾過的“蛋盒”模型[80]。低酯果膠與鈣離子反應(yīng)時只有較少的二聚作用，沒有明顯的二聚體形成步驟，也沒有二聚體的橫向結(jié)合[81]。本章利用酸水解法制備高G含量海藻酸鈉片段，命名為高G片段（GB）。利用酶解法制備低分子量低酯果膠，命名為（LMP）。采用熒光標(biāo)記、流變學(xué)實驗和離子色譜等方法研究在鈣離子存在的條件下，GB-DMB和GB-LMP混合“蛋盒”模型的形成。
不同 r[G]GB/([G]DMB+[G]GB)的混合體系在不同鈣膠比 R（Ga/G）下的熒光強(qiáng)度變化，如圖 5-4 所示，其中 GB 為被熒光標(biāo)記過的物質(zhì)，DMB 為沒有被熒光標(biāo)記的物質(zhì)。圖 5-4（a~g）為鈣膠比分別為 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50，不同 GB 含量下熒光光譜，由圖可知在波長為 520 nm 到 620 nm 之間時，其熒光強(qiáng)度隨著 GB 濃度升高而升高，最大吸收波長在 531 nm 處。圖 5-4（h）為最大吸收波長時不同混合體系在不同鈣膠比下的熒光吸收值，由圖可知，隨著 GB 濃度的升高，其熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)線性增加，與鈣離子的濃度無關(guān)。如果 GB 能夠與 DMB 發(fā)生混合絡(luò)合，長鏈的 DMB 分子會使標(biāo)記過的短鏈 GB 分子發(fā)生熒光猝滅[24]。因此在低鈣區(qū)，GB 與 DMB 沒有發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而是分別和鈣離子發(fā)生絡(luò)合。

圖 5-5 顯示了鈣離子誘導(dǎo)的海藻酸鈉儲能模量對時間的依賴關(guān)系，實心組為加入了高 G 片段（GB）的實驗組，空心組為沒有添加高 G 片段（GB）的對照組。由圖可知，在 R=0.6、1.8 和 2.4 時，GB 的加入并不能使體系的儲能模量 G′增加，即凝膠強(qiáng)度沒有增加。相反 GB 的加入反而使儲能模量 G′減小，這是由于鈣離子沒有達(dá)到飽和，GB 占據(jù)了部分鈣離子，導(dǎo)致與 DMB 絡(luò)合的鈣離子數(shù)量減小。由于 GB 分子量較低，對于凝膠強(qiáng)度基本沒有影響[22]，因此儲能模量會減小。在 R=3.0和 R=3.6 條件下，實驗剛開始時實驗組的儲能模量 G′要比對照組低，這是由于實驗組體系中的鈣離子在 GDL 的作用下緩釋，一開始鈣離子濃度要少于對照組，因此其儲能模量 G′要小于對照組的儲能模量 G′。隨著時間的增加，實驗組中鈣離子完全釋放，實驗組的儲能模量 G′逐漸與對照組一致。隨著時間繼續(xù)增加，實驗組的儲能模量 G′大于對照組實驗，說明 GB 的存在增加了體系的凝膠強(qiáng)度，此時短鏈的高 G 片段作為交聯(lián)劑與海藻酸鈉反應(yīng)，使體系的凝膠強(qiáng)度增加。

第 6 章 結(jié)論與展望

6.1 結(jié)論
本研究以三種不同的海藻酸鈉為研究對象，首先對海藻酸鈉樣品進(jìn)行分子表征，然后采用相對粘度和圓二色譜法，研究海藻酸鈉與不同堿土金屬離子的絡(luò)合機(jī)理；同時利用流變實驗對海藻酸鈉與不同堿土金屬離子的臨界凝膠行為進(jìn)行了研究；最后結(jié)合熒光標(biāo)記、流變學(xué)實驗和離子色譜等方法，研究了在鈣離子存在的情況下，高 G 片段和海藻酸鈉、果膠混合“蛋盒”模型的形成。得出以下結(jié)論：
（1）凝膠滲透色譜-多角度激光光散射儀（GPC-MALLS）和固有粘度兩種方法測定的海藻酸鈉分子量基本一致。核磁共振結(jié)果表明，DMB 樣品的 G 單元含量及G 嵌段的平均長度均大于 DM 樣品和 Sigma 樣品。
（2）海藻酸鈉與鈣離子和鍶離子絡(luò)合時呈現(xiàn)多步驟，分子尺寸呈現(xiàn)出先減小后增加再減小的趨勢；與鎂離子不發(fā)生絡(luò)合；與鋇離子絡(luò)合時分子尺寸呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢。海藻酸鈉與鍶離子絡(luò)合形成二聚體的 R 值隨著海藻酸鈉濃度的升高而降低，最后穩(wěn)定在 R=0.05，與鈣離子有所差異，可能不遵循“蛋盒”模型。鋇離子與海藻酸鈉絡(luò)合呈現(xiàn)兩步驟，并沒有單體復(fù)合物和類似“蛋盒”模型的結(jié)構(gòu)形成。
（3）利用葡萄糖酸內(nèi)酯酸化 M2+-EDTA（M 為 Ca、Sr 和 Ba）溶液，緩慢釋放堿土金屬離子，研究了不同堿土金屬離子引入量時，混合體系的粘彈性。得出在臨界凝膠點時，堿土金屬離子與羧基的摩爾比分別為 0.15、0.05、0.0125。利用Winter-Chambon 自相似模型、臨界凝膠點模量松弛法，并結(jié)合標(biāo)度理論計算臨界凝膠指數(shù)，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈣和海藻酸鋇的凝膠指數(shù)與逾滲模型預(yù)測的 0.71 基本一致，表明二者的凝膠結(jié)構(gòu)類似于隨機(jī)形成的電網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，適用于標(biāo)度定律，而海藻酸鍶的臨界指數(shù)與逾滲模型的預(yù)測值相差很大，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生長不具有完全隨機(jī)性，不適用于標(biāo)度定律。

（4）利用酸水解法制備出了高 G 片段，利用酶解法制備出了低分子量低酯果膠 LMP。運用熒光標(biāo)記、流變學(xué)實驗和離子色譜手段分別對高 G 片段-海藻酸鈉與鈣離子的混合絡(luò)合行為、高 G 片段-低分子量低酯果膠與鈣離子的混合絡(luò)合行為進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在低鈣區(qū)，高 G 片段與海藻酸鈉不存在混合絡(luò)合行為；在高鈣區(qū)，高 G 片段會促進(jìn)海藻酸鈉的凝膠。高 G 片段與果膠可能存在混合絡(luò)合行為。

參考文獻(xiàn)（略）

本文編號：42612