1 緒論 

1.1 葡萄的生物學研究概況 
葡萄（Vitis）屬落葉藤本植物，同屬植物約有 60 多種，其中 20 多種果可食或作砧木用，葡萄是世界上最古老的果樹之一，幾乎占全世界水果產量的四分之一。除果實能夠用來生食外，還可釀酒或制葡萄干等；根、藤等可以入藥，具有非常高的營養(yǎng)價值；歐洲葡萄(Vitis  vinifera)的栽培歷史長達 5000 多年。全世界約有 80%的葡萄生產用于釀酒，由于葡萄酒具有多種保健功能，有益于身體健康，因此許多國家對葡萄酒的購買力不斷增加。世界范圍內關于葡萄的產業(yè)研究及相關的分子生物研究一直是個熱點。研究者已經完成葡萄基因組測序，因而為進一步研究葡萄家族基因提供了便利條件，同時對葡萄家族基因的研究和分析也將為其功能、進化關系和基因表達等方面的研究提供科學參考。
......... 

1.2 芪類化合物的研究進展 
芪類化合物是植物在抵御生物、非生物脅迫及環(huán)境惡化條件下產生的植保素。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)一些芪類化合物有抑制人的皮膚真菌和皮膚細菌、抗血小板凝集、抗低密度脂蛋白氧化、調節(jié)雌激素、抗增殖、誘導細胞凋亡、抗癌抗氧化等醫(yī)療保健功能，這引起了人們極大的興趣和廣泛關注。芪類化合物以二苯乙烯為結構母核，廣泛存在于葡萄等植物中，多數(shù)分布在植物的木質部，最早從蓼科植物大黃中被發(fā)現(xiàn)[1,2]。目前，研究者已從23科59屬植物中分離得到芪類化合物[1]，并且發(fā)現(xiàn)一些微生物如酵母[3]、鏈霉菌屬[4]和細菌[5]中也存在芪類化合物。 芪類化合物的合成來源于苯丙氨酸代謝途徑[6]。苯丙氨酸首先在苯丙氨酸裂解酶(PAL)催化下裂解為肉桂酸，然后在肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)的作用下形成反式香豆酸，在香豆酸-CoA 連接酶(4CL)催化下形成反式香豆酰-CoA，1 分子的反式香豆酰-CoA 和 3分子的丙二酰-CoA可在芪合酶(stilbene synthase,STS)的作用下合成芪類次生代謝物白藜蘆醇（resveratrol,Res）；或者由肉桂酸直接形成肉桂酰-CoA，之后與丙二酰-CoA 在芪合酶作用下合成另一種芪類化合物赤松素(pinosylvin)（圖 1.1）。此外，反式香豆酰-CoA等也能夠在查爾酮合酶（chalcone  synthase,CHS）的催化作用下進入黃酮類和異黃酮類合成支路[7]。因而得出結論，芪合酶 STS 是植物中合成芪類化合物的關鍵酶。迄今為止，研究者已從葡萄、花生、大黃、高粱、原始裸蕨屬植物以及松樹等植物中發(fā)現(xiàn)了芪合酶基因，這些基因的分離為研究芪類化合物生物合成的調控機制等奠定了重要基礎。已克隆的STS基因可分為兩種類型[8]，一種以反式香豆酰-CoA為特異性底物，稱為白藜蘆醇合酶（resveratrol synthase, RS），另一種以肉桂酰-CoA為特異性底物，稱為赤松素合酶(pinosylvin synthase, PS)。葡萄、花生、大黃、高粱等被子植物中的芪合酶歸為前一種類型RS，而存在于裸蕨屬植物和松樹等植物中的芪合酶歸為后一種類型PS。  
.........

2 葡萄 STS 基因的克隆 

2.1 實驗材料和儀器
2.1.1 實驗材料 
（1）  植物材料 葡萄（Vitis vinifera L.）葉片，取自本實驗室葡萄種植區(qū)。 
（2）  菌株和載體 菌株為 E.coli DH5α，載體為 pEASY-T1 Simple Cloning Vector。 

2.1.2 溶液的配制 
（1）DEPC 水：1L ddH2O 中加入 1mL DEPC 原液，配制 1‰ DEPC 水，攪拌混勻，在 37℃過夜后高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?（2）50×TAE：Tris 242g，冰乙酸  57.1mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100mL，加純水定容至 1L。 （3）LB 培養(yǎng)基（100mL 體系）：在三角瓶中，分別加入胰蛋白胨(Tryptone)1g；酵母提取物(Yeast Extract)0.5g；NaCl 1g；加 ddH2O 定容到 100mL，，滅菌，4℃保存（固體的則還需加 1.5g 瓊脂）。 （4）2×YT 培養(yǎng)基（100mL 體系）：在三角瓶中，分別加入胰蛋白胨(Tryptone)1.6g；酵母提取物(Yeast Extract)1g；NaCl 0.5g；加純水定容至 100mL，高壓滅菌，于 4℃保存?zhèn)溆谩?（5）X-gal：將 20mg X-gal 加入到含 1mL DMF 溶液的 1.5mL Eppendorf tube 中，混勻，得到終濃度是 20mg/mL，-20℃避光保存。 （6）IPTG（200mg/mL）：在 1.5mL EP 管中加入 800μL 超純水，并將 200mg 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入 EP 管中充分溶解，然后用 0.22?M 的濾膜對其進行過濾滅菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?nbsp;
.........

2.2 實驗方法

在NCBI-UniGene數(shù)據(jù)庫中以stilbene synthase為關鍵詞進行搜索，找到歐洲葡萄 STS 基因的 EST 序列，將結果中具有重疊部分的序列用 DNAMAN 軟件進行比對、拼接、組合成較長的復合 EST 序列。使用 NCBI 中的ORF  Finder 和 CD  Search 工具預測拼接的復合 EST 序列是否具有完整的開放閱讀框（ORF）、所編碼的氨基酸序列是否具有 STS 保守結構域，從中選擇具有完整 ORF 且編碼的氨基酸具有 STS 保守結構域的序列，通過序列比對和基因組定位分析，去除部分重復的 STS 基因,  最終得到 6 個具有完整 ORF 的不同 STS 基因。根據(jù)基因組定位信息對得到的6個基因進行編號并依次命名為VvSTS1~VvSTS6。選擇其中的VvSTS2和VvSTS6進行分子克隆。將回收產物與 pEASY-T1 Simple Cloning Vector 進行連接，連接反應體系（5μL）如下：PCR 回收產物 3μL，pEASY-T1 Simple Cloning Vector 1μL，滅菌水補足至總體積 5μL。反應條件：25℃，5min。反應結束后，將離心管置于冰上。 

.........

3  葡萄 STS 基因的生物信息學分析 ......... 16 
3.1  材料與方法 ...... 16 
3.1.1  材料 ....... 16 
3.1.2  方法 ....... 16 
3.2  結果與分析 ...... 17 
3.3  本章小結 .......... 26 
4  不同物種 STS 基因的分子進化研究 ..... 27 
4.1  材料與方法 ...... 27 
4.1.1  材料 ....... 27 
4.1.2  軟件與方法 ......... 27 
4.2  結果與分析 ...... 27 
4.2.1 12 種不同植物 STS 基因密碼子適應指數(shù)分析 ......... 27 
4.2.2  不同物種 STS 多序列比對和系統(tǒng)進化分析 ..... 28 
4.2.3  不同物種 STS 保守結構域分析 .... 30 
4.3  本章小結 .......... 34 
5  不同脅迫處理后葡萄 STS 基因的表達 ........ 35 
5.1  材料處理 .......... 35 
5.2  實驗方法 .......... 35 
5.2.1  葡萄 RNA 的提取、純化及 cDNA 的合成 ....... 35 
5.2.2  引物設計 ...... 35 
5.2.3  實時定量 PCR 檢測 ......... 35 
5.3  實驗結果 .......... 36
5.3.1  葡萄總 RNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測 ........ 36 
5.3.2  實時定量 PCR 檢測 ......... 36 
5.4  結果分析 .......... 38 

5 不同脅迫處理后葡萄 STS 基因的表達 

5.1 材料處理 
在三株葡萄樹上，分別取 6 片大小相仿且基本完好無損傷的新鮮葉片，依據(jù) VvSTS6基因啟動子順式作用元件分析結果，在常溫下進行以下處理： （1）赤霉素（GA）處理：用 2mM  GA 溶液涂抹第一株葡萄的 5 個葉片，處理 0h（對照組）、6h、12h、24h、36h 和 48h 后取樣。 （2）脫落酸（ABA）處理：用 2mM ABA 溶液涂抹第二株葡萄的 5 個葉片，處理0h（對照組）、6h、12h、24h、36h 和 48h 后取樣。 （3）UV 輻射處理：用 UV 輻射第三株葡萄的 5 個葉片，處理 0h（對照組）、6h、12h、24h、36h 和 48h 后取樣。 取樣后將樣品立即置于液氮中冷凍，于-80℃條件保存?zhèn)溆�。本實驗中分別采用 GA、ABA、UV 處理葡萄葉片，結果表明 VvSTS6 基因的表達量發(fā)生了不同程度的變化（圖 5.2）。實時熒光定量 PCR 結果顯示：葡萄葉片經過 GA 處理后，VvSTS6 的表達量在 0-24h 時期內顯著增加，在 24h 時表達量達到峰值，是未處理組的 5 倍多，處理 36h 時出現(xiàn)下調表達，表達量下降到峰值的 1/2 左右，之后 VvSTS6的表達量繼續(xù)下降，到處理 48h 時大約為 0h 時表達量的 2 倍（圖 5.2A）。葡萄葉片經過 ABA 處理后，VvSTS6 基因表達量的變化呈現(xiàn)出與 GA 處理相同的趨勢：先上升至峰值后下降。在處理 48h 時的基因表達量也為 0h 時表達量的 2 倍左右（圖 5.2B）。葡萄葉片經 UV 輻射處理后，在 0-48h 時間段內表達量處于持續(xù)增加狀態(tài)，在 0-24h，基因表達量迅速上升，24h 時積累量約為 0h 的 5.3 倍，之后表達量繼續(xù)增加，只是上升趨勢沒有之前明顯，48h 時表達量接近 0h 初始水平的 6 倍（圖 5.2C）。 
..........

結    論

本課題以歐洲葡萄葉片作為研究材料，分離得到了葡萄 STS 基因家族中的一個成員VvSTS6，經測序鑒定及序列比對分析證實其確實是歐洲葡萄 STS 基因。 對從 NCBI-UniGene 數(shù)據(jù)庫中查找到的序列進行比對拼接，得到六個不同的 VvSTS基因，對它們的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進行了相關生物信息學分析。結果表明葡萄 STS 家族蛋白具有相同的保守結構域 CHS-like；相似的理化性質、功能位點、二級結構和三級結構，其二級結構主要由 α 螺旋和隨機卷曲組成；葡萄 STS 屬于弱親水性胞漿蛋白；葡萄 STS 基因能夠響應多種脅迫信號通路；葡萄科植物 STS 具有不同程度的相似性，符合種屬間親緣關系。 查找與 VvSTS6 基因編碼的氨基酸序列有較高相似性的其他物種 STS 氨基酸序列及其對應的基因編碼區(qū)序列，對不同物種 STS 基因進行分子進化研究，結果表明不同植物中 STS 具有相對保守的結構；STS 在物種間的進化符合物種進化規(guī)律；STS 保守結構域的分析證實了物種進化關系穩(wěn)定。 對葡萄葉片進行 GA、ABA、UV 輻射處理，采用實時熒光定量 PCR 法研究 VvSTS6的表達情況，結果顯示 GA、ABA、UV 脅迫均能促進 VvSTS6 的表達，說明 VvSTS6 能響應這些脅迫信號通路，進而證實 STS 基因參與植物抵御逆境脅迫過程。 綜上所述，本課題為深入研究葡萄 STS 基因提供了重要信息和理論依據(jù)，也為利用生物信息學方法深入研究其他基因家族提供了新思路。此外，本課題對進一步探究芪類化合物合成的分子機制、采用基因工程技術生產芪類化合物等也具有一定參考價值。  
.........
參考文獻(略)

本文編號：54306