1引言

近年來(lái)，很多企事業(yè)單位從歐美及日本等國(guó)家大量引進(jìn)彩色葉植物新品種，其中有的品種表現(xiàn)優(yōu)良；很多品種適應(yīng)性較差，對(duì)我國(guó)園林建設(shè)具有潛在不良影響。其實(shí)，我國(guó)彩葉樹(shù)種資源十分豐富，很多彩葉樹(shù)種資源尚未深入研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用，元寶楓就是其中值得深入研究的一個(gè)樹(shù)種。元寶楓（Acer truncatum Bunge），為槭樹(shù)科（Aceraceae）槭樹(shù)屬的落葉喬木，其種內(nèi)葉色、葉形變異廣泛，但是，在華北、華東的城市園林中，多數(shù)元寶楓植株的葉色表現(xiàn)一般，而‘魯紅 1 號(hào)’是課題組經(jīng)多年研究選育出的元寶楓的一個(gè)品系，其秋葉鮮紅，紅葉持續(xù)的時(shí)間很長(zhǎng)，觀賞價(jià)值高，更適合作庭蔭樹(shù)、行道樹(shù)或風(fēng)景林樹(shù)種。目前，我國(guó)對(duì)彩色葉植物的研究處于初級(jí)階段。對(duì)它的研究主要集中在栽培和開(kāi)發(fā)利用方面，分子生物學(xué)方面的研究很少，沒(méi)有完整的分子層面上的研究體系，嚴(yán)重阻礙了彩葉植物在葉色方面分子育種的研究進(jìn)程。‘魯紅 1 號(hào)’為開(kāi)展元寶楓分子生物學(xué)研究提供了優(yōu)良試材，通過(guò)對(duì)其葉片色彩表達(dá)的分子機(jī)理研究，為槭屬彩葉品種的分子育種、為彩色葉植物的人工調(diào)控葉色、定向培育彩色葉植物奠定基礎(chǔ)。

1.1植物花色苷的研究進(jìn)展
花色苷廣泛存在于植物中，是決定植物花、果實(shí)和葉片等的顏色的重要色素之一�；ㄉ帐潜奖彼岽x途徑的產(chǎn)物，它是一類水溶性色素，在細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中合成，運(yùn)輸?shù)揭号莺螅尸F(xiàn)出紅色、黃色、藍(lán)色和紫色等豐富的色彩（Gillian，2001；Martin et al.，1993）�；ㄇ嗨剀湛烧T導(dǎo)根瘤菌，，抑制病蟲(chóng)害，吸引昆蟲(chóng)傳粉，使果實(shí)免受紫外光傷害等，花色素苷又有抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、延緩衰老的作用（Kramer et al.，2004；Nakaishi et al.，2000；Tsuda et al.， 2003），人體保健功能也備受人們注視。
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1.2葉色基因工程及展望
花色苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，為類黃酮代謝途徑的各支路工程開(kāi)展奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)，且取得了矚目的成績(jī)，尤其是將基因工程技術(shù)應(yīng)用于觀賞植物花色的分子育種（即花色基因工程）更是取得了巨大的成功，相對(duì)于成功進(jìn)入市場(chǎng)的轉(zhuǎn)基因花卉來(lái)說(shuō)將基因工程技術(shù)應(yīng)用于彩葉植物葉色的分子育種還處于起步階段，并且相對(duì)于花瓣來(lái)說(shuō)葉片的呈色機(jī)理和調(diào)控機(jī)理更復(fù)雜得多，這就更不利于葉色基因工程的進(jìn)展。目前為止，仍未見(jiàn)應(yīng)用。至今，國(guó)內(nèi)外對(duì)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值及廣泛園林用途的彩色葉植物的葉色呈色機(jī)理研究報(bào)道較少。因此，從分子方面研究彩色葉植物葉色的呈色機(jī)理具有重要的理論意義及實(shí)際價(jià)值。進(jìn)而在葉片呈色的分子機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，借鑒類黃酮和花色基因工程的一些策略，可以有目的開(kāi)展葉色基因工程。具體的可以從這些方面入手：研究影響葉色呈色的生理生化機(jī)制，從分子生物學(xué)的角度研究彩葉變色過(guò)程中的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)變化，進(jìn)行葉色的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及定向分子育種的研究，使常綠樹(shù)種形成彩葉，并繁殖和培育出更多豐富多彩的彩色葉植物。這將是今后彩色葉植物重要的研究?jī)?nèi)容，也將是彩色葉植物廣泛應(yīng)用于城市園林綠化的基礎(chǔ)。
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2材料與方法

2.1材料
2.1.1植物材料
本試驗(yàn)的供試材料包括‘魯紅1號(hào)’原株及其自由授粉子代家系，以普通元寶楓為對(duì)照�！敿t1號(hào)’為課題組選育的秋葉鮮紅的元寶楓新品系，位于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地；其家系對(duì)比試驗(yàn)林設(shè)在濟(jì)南百合園林集團(tuán)的苗圃中，實(shí)驗(yàn)林始建于2010年春，現(xiàn)已經(jīng)達(dá)5年，長(zhǎng)勢(shì)良好。

2.1.2 菌株及載體
本實(shí)驗(yàn)研究用的大腸桿菌DH5a菌株和基因克隆載體pMD18-T Vector均購(gòu)自于大連寶生物生物工程有限公司。

2.1.3試劑盒、生化試劑
TRIZOL試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；EASY spin Plus 植物RNA快速提取試劑盒購(gòu)自于北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209-02）北京天根生化科技有限公司；MightyAmp? DNA Polymerase Ver.2 試劑盒、EasyTaqTM First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù) 有 限 公 司 ； 5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0（18374-058）試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit（634923）試劑盒購(gòu)自Clontech 公司。實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中所用的試劑DEPC 、CTAB、EDTA-Na2?2H2O、Tris、PVP、β-巰基乙醇、SDS、EB、Amp、IPTG、X-gal、瓊脂糖、瓊脂粉、酵母粉、胰蛋白胨等純?cè)噭┚?gòu)于大連寶生物工程有限公司；DL2000 分子 Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；CaCl2、甲醇、LiCl、NaCl、NaAc、NaOH、冰乙酸、濃鹽酸、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇等試劑均購(gòu)自北京索萊寶生物工程有限公司；部分水是用超純水。
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2.2方法
參照王慧聰?shù)龋ㄍ趸勐數(shù)龋?004）的方法，以株為實(shí)驗(yàn)單元，每個(gè)時(shí)間段每株樹(shù)分別采集葉片，采集后，立即用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。將葉片切碎混勻，取 0.5 克葉片于離心管，加10ml1%Hcl/甲醇溶液，放于 4℃冰箱中浸提 2h。用分光光度計(jì)測(cè)各提取液在553nm 和 600nm 處的吸光值。以每克葉片質(zhì)量的提取液的光密度變化值D553nm-D600nm=0.01 作花色苷單位，用 U 表示。核酸蛋白分析儀檢測(cè)：取1μl RNA樣品，用ND-2000核酸蛋白分析儀進(jìn)行含量以及純度的測(cè)定。電泳檢測(cè)：（1）稱0.2g瓊脂糖于容器中，加入20ml電泳緩沖液，加熱溶解，冷卻到60℃時(shí)加入0.5μl的EB染色。（2）將凝膠液倒入槽中，約凝固半個(gè)小時(shí)。（3）待膠凝好之后拔出梳子，將膠放入電泳槽中，點(diǎn)樣（5ul RNA+1μl 6×Loading Buffer）（4）在和l×TAE緩沖液下，10 V/cm 穩(wěn)壓條件下電泳15 min，對(duì)RNA純度和完整性進(jìn)行電泳檢測(cè)。
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3 結(jié)果與分析.....26
3.1‘魯紅 1號(hào)’葉片花色苷含量及葉色......26
3.2‘魯紅 1號(hào)’自由授粉子代的葉色表現(xiàn).........27
3.3‘魯紅 1號(hào)’ MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆......31
3.3.1‘魯紅 1號(hào)’葉片總 RNA 的質(zhì)量與產(chǎn)率....31
3.3.2 ‘魯紅 1號(hào)’ MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的分離.........32
3.3.2.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子基因 cDNA 的全長(zhǎng)..... 33
3.3.2.2 核酸序列分析......34
3.3.2.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)........36
3.3.2.4氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)分析.......36
4 討論..........38
4.1‘魯紅 1號(hào)’葉片花色苷含量及葉色......38
4.2‘魯紅 1號(hào)’葉色性狀的遺傳模式..........38
4.3‘魯紅 1號(hào)’葉片總 RNA 提取.........39
4.4 ‘魯紅 1號(hào)’MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因....40
5 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)........42
5.1結(jié)論.......42
5.2創(chuàng)新點(diǎn)..........42

4討論

4.1‘魯紅 1號(hào)’葉片花色苷含量及葉色

花色苷廣泛存在于植物體內(nèi)，是決定植物的葉、花、果實(shí)等顏色的重要因素之一�；ㄉ盏纳锖铣沙耸苷{(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的協(xié)同調(diào)節(jié)之外，還受到內(nèi)在激素和外在環(huán)境的影響，同時(shí)外在環(huán)境影響因素主要包括光照和溫度。各種樹(shù)在秋末的時(shí)候花色苷含量均在不同程度上逐漸升高,這是因?yàn)闇囟炔粌H在基因轉(zhuǎn)錄水平上影響花色苷的生物合成，也對(duì)花色苷的穩(wěn)定有影響，而低溫會(huì)誘導(dǎo)與花色苷合成相關(guān)的基因表達(dá)，從而使花色苷含量升高。在彩色葉植物的葉片漸漸趨于衰老過(guò)程中,花色苷含量升高能夠起到保護(hù)葉片細(xì)胞和光合結(jié)構(gòu)的作用。葉片的色澤在花色苷種類一定的條件下，主要受到花色苷的含量的影響。葉片中花色苷含量與葉片的轉(zhuǎn)色過(guò)程有密切關(guān)系，且不同的種、品種之間存在著一定差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：花色苷的積累與葉片的發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)：伴隨著葉片的發(fā)育‘魯紅1號(hào)’葉片中的花色苷的含量在轉(zhuǎn)色盛期達(dá)到高峰，之后伴隨著葉片的衰老花色苷的含量逐漸降低，同時(shí)葉片的顏色由最初的淡紅色到深紅色最后變?yōu)榘导t色（如附圖說(shuō)明中的圖1、2、3、4）。其它兩種對(duì)照元寶楓的葉片花色苷含量變化趨勢(shì)與‘魯紅1號(hào)’的無(wú)異，‘魯L-2’植株葉片中花色苷含量只是在原來(lái)的基礎(chǔ)上有著輕微的變動(dòng)，‘魯紅1號(hào)’葉片中花色苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出于其它兩種對(duì)照元寶風(fēng)的含量。顯示在葉色上就表現(xiàn)為‘魯紅1號(hào)’秋季葉片的葉色比‘魯C-1’和‘魯L-2’的要紅的多（如附圖說(shuō)明中的圖1、2、3、4、5、6）。由此我們推測(cè)，‘魯紅1號(hào)’葉片的呈色差異在于花色苷積累的多少。

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結(jié)論

本研究主要以‘魯紅1號(hào)’及其自由授粉子代家系為研究材料，測(cè)定了花色苷含量及從連續(xù)5年的秋季葉片葉色參數(shù)，提取秋季葉片總 RNA，并通過(guò) PCR成功的克隆了MYB轉(zhuǎn)錄因子基因。本研究的主要結(jié)論如下：
1. ‘魯紅1號(hào)’葉片花色苷的含量在轉(zhuǎn)色期呈先上升后下降的趨勢(shì)，且是對(duì)照的兩倍還要多，且其葉片花色苷的含量與葉色參數(shù)a呈正相關(guān)。
2.‘魯紅1號(hào)’自由授粉子代在秋季轉(zhuǎn)色期有90%左右的個(gè)體葉色呈紅色或偏紅，年度間較穩(wěn)定，具有顯性特征，推測(cè)屬于核基因控制。
3.建立了改良 CTAB 法提取‘魯紅1號(hào)’葉片總 RNA，提取的總 RNA 純度高、濃度大，達(dá)到 RT-PCR 及建立文庫(kù)的要求，同時(shí)該方法也為其它多糖多酚植物的總 RNA提取提供借鑒。
4. 克隆了MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，經(jīng)氨基酸比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)分析、生物信息分析結(jié)果都證實(shí)了MYB屬 R2R3MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，推測(cè)具有調(diào)控‘魯紅1號(hào)’花色苷生物合成的功能。該MYB轉(zhuǎn)錄因子基因被命名為L(zhǎng)H-MYB。
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：38865