第一章 緒論

1.1 鐮刀菌毒素概述
鐮刀菌是農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的重要病原菌，主要侵染玉米、小麥、大麥、燕麥等多種作物及其加工制品（玉米片、麥芽、啤酒、面包等）。鐮刀菌毒素（Fusarium mycotoxin）是鐮刀菌生長過程中產(chǎn)生的多種有毒代謝產(chǎn)物，在自然界中分布極為廣泛，，是最危險(xiǎn)的食品污染物之一，對(duì)人畜健康危害十分嚴(yán)重。因此，關(guān)于鐮刀菌毒素的研究已成為當(dāng)前國際上最緊迫的課題之一[3]。玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏馬菌素（FMs）和 T-2 毒素是主要的鐮刀菌毒素[4]，具有重要的食品衛(wèi)生學(xué)意義，后續(xù)章節(jié)將分別對(duì)其進(jìn)行具體介紹。
1.1.1 污染危害
雖然不同的鐮刀菌毒素其理化性質(zhì)和毒理作用不盡相同，但它們的基本特點(diǎn)是：（1）嚴(yán)重危害人畜健康，可引起腦、肝、腎、皮膚等組織器官或免疫、神經(jīng)、生殖系統(tǒng)的損傷[5-8]。（2）分子量小、耐熱，一旦污染糧食或飼料很難被去除，蒸煮、煎炸等通常的烹調(diào)條件對(duì)其幾乎或根本沒有破壞作用[2]。（3）污染對(duì)象廣泛，常被發(fā)現(xiàn)于作為人類食品和動(dòng)物飼料重要組成的各類作物及其加工產(chǎn)品中[9]。（4）其污染具有高頻率發(fā)生的特點(diǎn)，在作物的田間生長、收獲，糧食或飼料的儲(chǔ)藏、加工、運(yùn)輸、銷售過程中，均有可能遭受污染�？梢哉f，鐮刀菌毒素等真菌毒素的存在，是一種固有的風(fēng)險(xiǎn)[10]，其污染與危害在世界范圍內(nèi)普遍存在。
鐮刀菌毒素對(duì)人畜健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的負(fù)面影響甚大。其污染可引起作物減產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值下降，導(dǎo)致直接經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）報(bào)告，每年全世界約有 25%的糧食作物受到不同程度的真菌毒素污染，造成的經(jīng)濟(jì)損失每年達(dá)數(shù)千億美元[11]。在我國，農(nóng)產(chǎn)品受真菌毒素污染危害更為嚴(yán)重，據(jù)統(tǒng)計(jì)真菌毒素超標(biāo)已成為我國農(nóng)產(chǎn)品出口歐盟的最大阻礙，高于公眾熟知的重金屬、農(nóng)藥殘留、食品添加劑等因素[12]。這其中因鐮刀菌毒素引起的經(jīng)濟(jì)損失不在少數(shù)。此外，當(dāng)動(dòng)物攝入鐮刀菌毒素污染飼料，會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)、繁殖性能下降，動(dòng)物產(chǎn)品如肉、奶、蛋等品質(zhì)降低，嚴(yán)重者畜禽因病死亡，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13]，典型案例即 2008 年美國出現(xiàn)的由于 T-2毒素污染導(dǎo)致的大面積畜禽死亡的現(xiàn)象[14]。當(dāng)鐮刀菌毒素進(jìn)入人類食物鏈，可引發(fā)人類多種急慢性疾病乃至死亡，導(dǎo)致一系列食品安全事件給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹司薮蟮拈g接經(jīng)濟(jì)損失，典型案例即二戰(zhàn)期間前西伯利亞阿穆爾地區(qū)，數(shù)千人因進(jìn)食了被鐮刀菌污染的越冬小麥而發(fā)生食物中毒。
1.1.2 檢測技術(shù)

針對(duì)真菌毒素引起的食品安全問題，至少 77 個(gè)國家制定了食品/飼料中真菌毒素可接受限量的單行法規(guī)[13]。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2011）也規(guī)定了食品中黃曲霉毒素 B1、黃曲霉毒素 M1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素 A 及玉米赤霉烯酮的限量指標(biāo)[15]。就目前國內(nèi)外的嚴(yán)峻形勢而言，加強(qiáng)食品中真菌毒素的檢測力度，建立高效快速的檢測方法，已成為我國當(dāng)下防止真菌毒素危害食品衛(wèi)生安全、保障國際貿(mào)易的重要任務(wù)�，F(xiàn)有的真菌毒素（含鐮刀菌毒素）檢測方法主要包括以下幾種：

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1.2 核酸適配體
1.2.1 適配體的概述
核酸適配體，簡稱為適配體（aptamer），是指一段具有特定復(fù)雜三維構(gòu)象的單鏈寡核苷酸（ssDNA 或 RNA），長度通常在 10-100 個(gè)堿基之間，該序列能與靶標(biāo)分子高親和力、特異性結(jié)合。1990 年，Tuerk 和 Gold[27]提出一種新的體外篩選技術(shù)，命名為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX，Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）技術(shù)，通過該技術(shù)篩選得到了噬菌體 T4 DNA 聚合酶的 RNA 配基。同年，Ellington 和Szostak[28]用類似方法成功篩選到了特異結(jié)合活性藍(lán)等有機(jī)染料小分子的 RNA 序列，并首次提出“aptamer”的概念，該命名來源于拉丁語 aptus（意為―合適‖）與希臘語 meros（意為“部分”）的組合。

適配體可以與細(xì)菌、病毒甚至組織器官等大分子靶標(biāo)相互作用（圖 1-1）；也可以與金屬離子、真菌毒素等小分子相互作用（圖 1-2）。適配體與其靶標(biāo)分子高親和力、特異性結(jié)合的原理是：單鏈寡核苷酸分子能通過鏈內(nèi)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并在氫鍵、靜電相互作用下發(fā)生自身折疊形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)（如莖、環(huán)、發(fā)夾、凸環(huán)、假結(jié)、G-四聚體等結(jié)構(gòu)）[29]，構(gòu)成與靶分子形狀匹配、緊密契合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；同時(shí)，堆疊的芳香環(huán)、靜電相互作用、范德華力、氫鍵或者這些影響的綜合作用也是適配體與靶分子特異相互結(jié)合的原因[30]。

1.2.2 適配體的優(yōu)點(diǎn)

與抗體相比，適配體具有如下優(yōu)勢：（1）親和力與抗體相當(dāng)（解離常數(shù) Kd值通常為 nmol/L 或 pmol/L 水平）；特異性甚至優(yōu)于抗體，抗體常有交叉反應(yīng)性，而適配體對(duì)靶標(biāo)分子具有高度專一性，能分辨一個(gè)甲基或羥基的差異。（2）靶標(biāo)對(duì)象范圍比抗原廣泛，可包括離子、有機(jī)染料、核苷酸、氨基酸、維生素、抗生素、農(nóng)藥、肽類、蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒、完整細(xì)胞、組織甚至器官等，從而適配體的應(yīng)用范圍比抗體更加廣泛。（3）初代適配體及迭代適配體的制備均不需依賴動(dòng)物或細(xì)胞免疫，一旦篩選到高特異性、高親和力的適配體序列，即可通過化學(xué)合成法直接制備高純度的適配體，制備準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性遠(yuǎn)優(yōu)于抗體；而抗體的制備周期長、生產(chǎn)成本高，制備的不同批次抗體間存在差異。據(jù)耶魯大學(xué)研究者 Low 等[32]估計(jì)，適配體的生產(chǎn)成本可以比抗體低約 10~50 倍。（4）適配體對(duì)溶劑、酸堿度或離子強(qiáng)度具有更好的耐受性，更重要的是具有耐熱性，僅需幾分鐘時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)適配體的可逆變性與復(fù)性；而抗體分子的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，貨架期較短，對(duì)溫度敏感，易遭受不可逆變性而失去用途。（5）易于化學(xué)修飾，可標(biāo)記上生物素、巰基、氨基、熒光染料、抗癌藥物等。（6）分子量比抗體小，更易滲透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，利于醫(yī)學(xué)影像診斷和臨床治療。（7）動(dòng)力學(xué)參數(shù)可按需要而改變，與靶分子的結(jié)合條件可控；而抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)不能被改變，因此抗體的應(yīng)用不如適配體的靈活、廣泛。（8）適配體具有堿基配對(duì)等單鏈核苷酸分子的性質(zhì)，可通過堿基配對(duì)的方法實(shí)現(xiàn)親和力調(diào)控，用于設(shè)計(jì)分子機(jī)器、邏輯門等[33]。（9）適配體與靶標(biāo)分子的結(jié)合通常依靠莖環(huán)、發(fā)夾、假結(jié)、G-四聯(lián)體等特殊的空間三維結(jié)構(gòu)，兩者的結(jié)合事件（binding events）導(dǎo)致適配體空間構(gòu)象變化而引發(fā)信號(hào)變化，為構(gòu)建基于適配體的生物傳感器提供了良好的可行性。

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第二章 玉米赤霉烯酮核酸適配體的篩選與分析應(yīng)用

2.1 前言
1962 年 Stob 等[2]首先從霉變玉米中分離出了 ZEN。該毒素的化學(xué)名稱為 6-（10-羥基-6-氧基-十一碳烯基）-β-雷鎖酸，分子式：C18H22O5，相對(duì)分子質(zhì)量 318.4，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖 2-1 所示，難溶于水、易溶于堿性水溶液和醇類，其甲醇溶液在紫外光下呈明亮的綠-藍(lán)色熒光[3, 4]。ZEN 廣泛存在于谷物中，主要污染玉米、大麥、小麥、燕麥、高粱和大米等作物，在面粉、麥芽、啤酒及奶制品、肉制品等產(chǎn)品中也有一定程度的分布。ZEN 對(duì)人類及動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重威脅，危害僅次于黃曲霉毒素[5]。它對(duì)動(dòng)物具有較強(qiáng)的生殖發(fā)育毒性和免疫毒性，可引起動(dòng)物雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致不孕、不育、胎兒畸形和生長發(fā)育不良[6]，對(duì)家禽特別是豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng) ZEN 通過被污染的作物和肉、奶、蛋等制品進(jìn)入人體后，對(duì)人體危害主要表現(xiàn)為生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、基因毒性、肝腎毒性，致腫瘤（子宮癌、乳腺癌、睪丸癌）毒性[7,8]。為了控制 ZEN 對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生的危害，目前世界多國已經(jīng)制定了針對(duì)食品、谷物、飼料中 ZEN 含量的限量標(biāo)準(zhǔn)。例如，我國最新的《GB2761-2011 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定供人食用的谷物及其制品，包括小麥、小麥粉及玉米、玉米面（渣、片）中ZEN的限量指標(biāo)為60 μg/kg[9]；《GB 13078.2-2006 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 飼料中赭曲霉毒素 A 和玉米赤霉烯酮的允許量》規(guī)定配合飼料、玉米中 ZEN 安全限量為 500 μg/kg[10]。澳大利亞規(guī)定谷物中 ZEN 的含量不能超過50 μg/kg，意大利規(guī)定在谷物和谷類產(chǎn)品當(dāng)中ZEN的含量不能超過100 μg/kg，法國規(guī)定谷物和植物油中 ZEN 的含量必須低于 200 μg/kg。2011 年，歐洲食品安全管理局下食物鏈污染物審查組確定了每日耐受攝入量（TDI）為 0.25 μg/kg 體重[11]。因此，建立一種準(zhǔn)確、靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)的 ZEN 檢測方法對(duì)于保障食品安全、提高貿(mào)易競爭力具有重大意義。

當(dāng)前 ZEN 檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）[12]、高效液相色譜法（HPLC）[13, 14]、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）[15]及基于抗原-抗體免疫識(shí)別建立的免疫法等。薄層層析法操作步驟較繁瑣，靈敏度及特異性低，已不能滿足現(xiàn)代檢測的需要。而常用的色譜分析法，樣品前處理方法復(fù)雜、繁瑣，且需要熟練掌握儀器操作技術(shù)，不便基層推廣。免疫法檢測 ZEN 近年來發(fā)展迅速，例如 Pei 等[16]利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測中國東北玉米中的 ZEN，檢測限為 0. 1 ng/g；Luo 等[17]用膠體金免疫層析法（GICG）測定 ZEN 的檢測限為 0.58 ng/mL，可在 5 min 內(nèi)由肉眼判斷結(jié)果完成檢測；Wang 等[18]建立了一種電化學(xué)免疫檢測 ZEN 的方法，其檢測限為 2 pg/mL；Choi 等[19]發(fā)展的熒光偏振免疫檢測法（FPIA），檢測限達(dá) 77 μg/kg，檢測時(shí)間僅需 3 min；Liu 等[20]利用競爭表面增強(qiáng)拉曼散射免疫檢測（SERSI）方法檢測 ZEN，其檢測限達(dá) 1 pg/mL。免疫法雖具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是小分子半抗原 ZEN 的抗體制備過程繁瑣耗時(shí)、成本昂貴，不同批次間抗體存在差異性，儲(chǔ)存及使用條件嚴(yán)苛，導(dǎo)致假陽性率高、重復(fù)性差。

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2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
2.2.1 主要材料與試劑
玉米赤霉烯酮（ZEN）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL），伏馬菌素 B1（FB1）、伏馬菌素B2（FB2），黃曲霉毒素 B1（AFB1）、黃曲霉毒素 B2（AFB2）毒素標(biāo)準(zhǔn)品，羧甲基羥胺半鹽酸鹽（CMO），碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酸亞胺（NHS），鏈霉親和素（SA），丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（29:1）試劑購自 Sigma-Aldrich 公司；Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL），dNTPmix（A、T、C、G 各 25 mmol/L 試劑），10×PCR 緩沖液（包含 Mg2+），GeneRuler Ladder（10-150 bp），過硫酸銨（AP），溴化乙錠（EB）等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）購自美國 SAFC公司；Lambda 核酸外切酶（5000 U/mL）、10×Lambda 核酸外切酶反應(yīng)緩沖液（670 mmol/LGlycine-KOH，25 mmol/L MgCl2，500 μg/mL BSA，pH 9.4）購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；TEMED 自美國 SAFC 公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），乙二胺四乙酸（EDTA），吐溫 20，牛血清白蛋白（BSA96% ~99%）均購自國藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑有限公司（上海）；玉米赤霉烯酮商品化 ELISA 試劑盒，江蘇蘇微微生物研究有限公司；生物素標(biāo)記的 ZEN 適配體序列及互補(bǔ)短鏈 DNA 序列，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；實(shí)驗(yàn)中用水均為超純水（電阻率 18.2 MΩ.cm）。
2.2.2 主要儀器和設(shè)備

HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），DZF6020 真空干燥箱（杭州同祺儀器有限公司），超聲波清洗儀（無錫科潔儀器設(shè)備公司），微量分析天平（奧豪斯儀器有限公司），pH 計(jì)（奧豪斯儀器有限公司），LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），Centrifuge 5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國 Eppendorf 公司），HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠），Nicolet Nexus 470 傅立葉變換紅外光譜儀（美國 Thermo 公司），C1000Thermocycler 擴(kuò)增儀（美國 Bio-Rad 公司），Chemi DocTMXRS+凝膠成像儀（美國 Bio-Rad公司），ND-1000 微量紫外可見分光光度計(jì)（美國 Nanodrop 公司），MOS-450/AF-CD圓二色譜儀（法國 Bio-logic 公司），F(xiàn)-7000 全波長熒光光譜儀（日本日立有限公司），LSM700 激光掃描共聚焦顯微鏡（德國 Zeiss 公司），Milli-Q3 Integral 純水/超純水一體化系統(tǒng)（密理博（中國）有限公司)。

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第三章 特異識(shí)別伏馬菌素 B1核酸適配體的篩選與鑒定.............. 47
3.1 前言....................................................... 47
3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備............................................... 48
3.2.1 主要材料與試劑............................................ 48
3.2.2 主要儀器和設(shè)備.............................................. 48
第四章 基于適配體特異識(shí)別的電化學(xué)阻抗譜檢測伏馬菌素 B1.......... 62
4.1 前言......................................................... 62
4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備.............................................. 63
第五章 非固定 GO-SELEX 篩選 T-2 毒素核酸適配體的研究............... 73
5.1 前言........................................................ 73
5.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備................................................. 74
5.2.1 主要材料與試劑............................................. 74

5.2.2 主要儀器和設(shè)備............................................ 75

第六章 基于適配體分離-乙酰膽堿酯酶抑制的T-2毒素可視化檢測方法研究

6.1 前言
T-2 毒素是 A 類單端孢霉烯族真菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種，毒性劇烈且分布廣泛，被列為自然界存在的最危險(xiǎn)的食品污染源之一，國際上非常重視 T-2 毒素的研究。到目前為止，測定食品或飼料中的痕量 T-2 毒素仍是一個(gè)困難的工作[1]。儀器分析法是 T-2毒素檢測的一種手段，包括的 LC-MS/MS[2]、UPLC-MS/MS[3]和 GC-MS/MS[4]等。這些儀器為基礎(chǔ)的分析方法依賴于昂貴的精密儀器設(shè)備和訓(xùn)練有素的人員，也需要包括提取、凈化和/或衍生等復(fù)雜的樣品前處理過程，因此不能普及應(yīng)用。另一種類型的檢測技術(shù)是免疫測定法，包括酶聯(lián)免疫吸附法 ELISAs[5, 6]、基于免疫測定的快速試紙條分析法[7]。免疫測定法靈敏度高，并且可廣泛用于大量樣品的同時(shí)分析。但是，免疫測定法離不開高質(zhì)量的 T-2 毒素抗體，而抗體的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。T-2毒素作為一種無偶聯(lián)活性基團(tuán)的小分子半抗原，將其與大分子載體蛋白結(jié)合制備完全抗原的過程十分繁瑣耗時(shí)、成本昂貴。因此，開發(fā)基于適配體新型識(shí)別元件的 T-2 毒素檢測方法是形勢所需。
上一章中介紹了運(yùn)用非固定GO-SELEX方法篩選特異識(shí)別T-2毒素的高親和力適配體，得到了一條最佳核酸適配體序列Seq.16。而第四章中，我們利用納米金電化學(xué)性質(zhì)建立的一種基于適配體識(shí)別阻抗檢測伏馬菌素B1的方法（檢測限2 pmol/L）。本實(shí)驗(yàn)擬利用納米金的優(yōu)秀光學(xué)特性，構(gòu)建一種納米金比色檢測T-2毒素的新方法。納米金比色法具有其他方法不可比擬的簡單快捷、無需復(fù)雜儀器、僅靠肉眼就能觀察等優(yōu)點(diǎn)，而且具有特異性和高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)，因此在快速檢測領(lǐng)域尤其是食品安全快速篩查領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。但是，納米金比色法本身也具有缺點(diǎn)，作為一種膠體溶液，容易受到基質(zhì)環(huán)境等影響而發(fā)生團(tuán)聚變色，因此利用納米金比色法檢測食品安全危害因子時(shí)，要盡可能去除可能的干擾物。目前，適配體在分離純化系統(tǒng)中顯示出巨大優(yōu)勢，而磁性納米顆粒生物分離技術(shù)日益發(fā)展成熟（具體闡述見緒論1.2.3及緒論1.4.1部分），在本文第二章研究中我們已成功將適配體與磁分離富集技術(shù)結(jié)合建立了特異檢測玉米赤霉烯酮的熒光檢測方法（檢出限785 pmol/L）。

此外，Liu 等[10]還根據(jù)殺蟲劑對(duì) AChE 酶的抑制作用，建立了一種基于羅丹明 B 標(biāo)記納米金的熒光、比色雙手段的高靈敏方法，用于檢測復(fù)雜體系中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。檢測原理是農(nóng)藥能抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，防止催化產(chǎn)物硫代膽堿的生成，阻止納米金團(tuán)聚變色。該法對(duì)農(nóng)藥西維因、二嗪農(nóng)、馬拉硫磷及甲拌磷的檢測最低限分別為 0.1，0.1，0.3 及 1.0 μg/L，具有較高的靈敏度和選擇性。在本章實(shí)驗(yàn)中，我們將巧妙地利用特異性識(shí)別T-2毒素目標(biāo)物的核酸適配體，將其修飾在磁性納米顆粒表面制備成捕獲探針，完成從復(fù)雜體系中分離目標(biāo)物T-2毒素的過程后，將其重新懸浮于緩沖液中，避免啤酒樣品等復(fù)雜基質(zhì)對(duì)比色分析實(shí)驗(yàn)的干擾。一系列分析驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，基于適配體Seq.16制備的捕獲探針能高效準(zhǔn)確地執(zhí)行從復(fù)雜食品基質(zhì)中捕獲目標(biāo)物T-2毒素的功能，提高檢測方法的靈敏度。本方法具有很好的靈敏度，對(duì)實(shí)際樣品檢測與 ELISA 方法對(duì)照具有很好的一致性。

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主要結(jié)論與展望

主要結(jié)論
本論文主要圍繞鐮刀菌毒素核酸適配體的篩選及其在食品安全檢測中的應(yīng)用展開研究。主要研究結(jié)果如下：
1、利用磁珠固定靶標(biāo)的競爭-SELEX 方法經(jīng)過 14 輪的篩選富集，獲得了特異識(shí)別玉米赤霉烯酮的高親和力 ssDNA 適配體 Z8，其序列為 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATAGTGGCCGCATATCTTTTTTGCGGTCGCTTGGCTCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'，解離常數(shù) Kd= 29±5 nmol/L。通過圓二色譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析適配體上與靶標(biāo)結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)是 TAC（CAT）、TAT 及 A=T 堿基對(duì)構(gòu)成的莖結(jié)構(gòu)。以該條特異結(jié)合玉米赤霉烯酮的適配體為捕獲探針，構(gòu)建了一種磁分離富集-熒光生物分析檢測玉米赤霉烯酮的新方法，在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下，玉米赤霉烯酮熒光強(qiáng)度值與其濃度對(duì)數(shù)值在3.14 nmol~31.4 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為 785 pmol/L，該方法可用于啤酒樣品中玉米赤霉烯酮的檢測。
2、利用磁珠固定靶標(biāo)的競爭-SELEX 方法經(jīng)過 13 輪的嚴(yán)格篩選，獲得了特異識(shí)別伏馬菌素 B1的高親和力 ssDNA 適配體 F10，其序列為：5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCGATCTGGATATTATTTTTGATACCCCTTTGGGGAGACATCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'，解離常數(shù) Kd為 62±5 nmol/L，為后續(xù)檢測方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。
3、以伏馬菌素 B1的特異識(shí)別核酸適配體 apF10 為識(shí)別元件，通過恒電位沉積法將納米金修飾在玻碳電極表面（粒徑為 50~100 nm），利用金-硫鍵作用將巰基化的伏馬菌素 B1適配體錨定在納米金上，建立了一種基于適配體識(shí)別的電化學(xué)阻抗譜檢測伏馬菌素 B1的新方法，在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下，電化學(xué)阻抗變化（Ret）與伏馬菌素 B1濃度對(duì)數(shù)值在 0.1 nmol/L-100 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為 2 pmol/L，該方法可用于玉米樣品中伏馬菌素 B1的檢測。
4、利用免固定靶標(biāo)的 GO-SELEX 方法，經(jīng) 10 輪的嚴(yán)格篩選富集到了 T-2 毒素適配體庫，富集率為 74%，考察了候選適配體全長序列及截短序列的親和力與特異性，獲得了特異性識(shí)別 T-2 毒素的 ssDNA 適配體 Seq.16，其序列為：5'-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3'，解離常數(shù) Kd值為 20.8±3.1 nmol/L。
5、以 T-2 毒素特異適配體 Seq.16 結(jié)合磁性納米顆粒構(gòu)建高效的捕獲探針，從待測樣品中分離富集目標(biāo)物 T-2 毒素，利用 T-2 毒素抑制乙酰膽堿酯酶活性從而阻礙納米金聚集變色的原理，建立了一種適配體體分離 T-2 毒素抑制乙酰膽堿酯酶的納米金比色檢測 T-2 毒素的新方法，在最優(yōu)檢測條件下得到 T-2 毒素濃度在 107 pmol/L~2145 pmol/L范圍內(nèi)與納米金溶液吸光度值 A520 nm呈良好的線性關(guān)系，檢出限為 107 pmol/L，該方法可用于啤酒樣品中痕量 T-2 毒素的檢測。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：35125