【背景】乳桿菌屬是發(fā)酵食品中最常見的微生物之一,與食品的品質(zhì)和安全密切相關,定量檢測乳桿菌活菌數(shù)、解析乳桿菌群落組成對發(fā)酵乃至腸道微生物等具有重要意義。【目的】建立一種在種水平上定量檢測5種乳桿菌活菌數(shù)的疊氮溴化丙錠-熒光定量PCR（propidium monoazide-quantitativePCR,PMA-qPCR）檢測方法并探討其適用性�！痉椒ā恳灾参锶闂U菌、發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌等發(fā)酵食品中常見的5種乳桿菌為目標菌株,查找并篩選特異性引物用于熒光定量PCR（qPCR）檢測,優(yōu)化疊氮溴化丙錠（PMA）處理條件,測定PMA-qPCR檢測法的特異性、靈敏度及可靠性。最后利用PMA-qPCR法檢測黃酒釀造過程中5種乳桿菌的活菌數(shù)�！窘Y果】PMA最佳處理條件為:濃度20μmol/L下暗處理15 min后曝光15 min,此時可抑制樣品中99.89%的死菌DNA擴增。該方法特異性高,能夠準確識別5種乳桿菌;線性關系強,R2>0.98;靈敏度高,檢測限為101.8-103.2 CFU/mL;重復性好,Cq值變異系數(shù)小于1%;與平板計數(shù)相比差異不顯著（統(tǒng)計學上）,... 

【文章來源】：微生物學通報. 2020,47(12)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

PMA優(yōu)化結果

黃酒是一種典型的多菌種混合發(fā)酵食品，具有復雜的發(fā)酵體系和微生物群落，檢測其中的微生物組成，尤其是在種水平上檢測乳桿菌的含量具有一定難度。本研究使用建立好的PMA-q PCR檢測法在種水平上對黃酒釀造過程中5種乳桿菌的活菌數(shù)進行了定量檢測。如圖4所示，隨著發(fā)酵時間的延長，黃酒發(fā)酵醪液中總乳桿菌的含量從1.2×106 CFU/m L逐漸降低至1.1×105 CFU/m L，與實驗室前期高通量測序測得的乳桿菌含量變化趨勢[5]相似，較低的乳桿菌含量可能與較低的核酸提取率有關(17.3-35.7 ng/μL)。發(fā)酵乳桿菌是黃酒中的優(yōu)勢乳桿菌，占總乳桿菌的25%-45%，尤其是在第3天時，發(fā)酵乳桿菌的含量達到了4.95×105 CFU/m L。干酪乳桿菌和短乳桿菌的含量雖然隨著發(fā)酵時間的延長在不斷下降，但其在乳桿菌屬中的占比卻在不斷上升，在發(fā)酵第18天時，干酪乳桿菌和短乳桿菌分別占比33.76%和27.93%。植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌在黃酒釀造過程中具有較低的含量，僅植物乳桿菌在第3天和第4天具有103.6 CFU/m L和102.9 CFU/m L，而在其他時間點的含量均低于檢測限。王然然等[25]通過分離培養(yǎng)的方式從黃酒發(fā)酵醪液中篩選到了58株乳桿菌，通過菌種鑒定發(fā)現(xiàn)其中34株是發(fā)酵乳桿菌，占有絕對優(yōu)勢。Yu等利用PCR-DGGE方法分析了黃酒釀造過程中細菌群落多樣性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌和植物乳桿菌在整個發(fā)酵過程中都具有較高的豐度[26]，與本文研究結果相似。Lv等采用PMA-q PCR法檢測了紅曲黃酒中植物乳桿菌的含量，發(fā)酵開始階段(1-5 d)植物乳桿菌的含量約為102.3-102.6 CFU/m L，隨后其含量逐漸上升至約106.7 CFU/m L (30 d)，到發(fā)酵結束其含量又下降至約106 CFU/m L (45 d)[10]，與本研究結果具有一定差異。釀造環(huán)境及工藝的不同可能是導致乳桿菌含量及變化差異的主要原因。圖4 PMA-q PCR法檢測黃酒釀造過程5種乳桿菌的含量

按照1.2.6的方法評估PMA-q PCR法檢測乳桿菌含量的可靠性，結果如圖3A所示，Cq值的變異系數(shù)均小于1%，表明在實驗濃度范圍內(nèi)，該方法具有良好的重復性。t檢驗證明在103-108 CFU/mL范圍內(nèi)，PMA-q PCR與平板計數(shù)法測得的不同乳桿菌的含量在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異(P>0.05)(Lactobacillus fermentum為103 CFU/mL時和Lactobacillus除外)(圖3B)。當樣品中發(fā)酵乳桿菌的含量接近檢測限103.2 CFU/mL時，PMA-q PCR的檢測準確性出現(xiàn)降低(P<0.05)，盡管如此，其檢測結果仍與平板計數(shù)檢測結果處于同一數(shù)量級(表4)。而較差的乳桿菌屬定量檢測結果反映了以16S rRNA基因為靶基因區(qū)域定量檢測的局限性，這與16Sr RNA基因在不同乳桿菌基因組DNA中的拷貝數(shù)不同有關。通過拷貝數(shù)矯正微生物組的豐度對于樣品中微生物檢測具有重要意義，文獻[24]表明通過rrn DB數(shù)據(jù)庫(https://rrndb.umms.med.umich.edu/)可以查找細菌和古菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)，進而矯正相應拷貝數(shù)。2.5 PMA-q PCR檢測法在黃酒釀造中的應用

【參考文獻】：
期刊論文
[1]T-RFLP和454焦磷酸測序方法分析制麥過程細菌群落的動態(tài)變化[J]. 邱然,陸健.  食品與生物技術學報. 2019(04)
[2]黃酒發(fā)酵過程中乳酸菌的分離及對其產(chǎn)生物胺能力的評價[J]. 王然然,李曉敏,陳柳,卞小穩(wěn),蔡國林,陸健.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2017(01)



本文編號：3329532