目的建立一種同時鑒定沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌的多重PCR快速檢測技術(shù),為水產(chǎn)品中食源性病原菌檢測提供新思路.方法基于沙門氏菌inv A基因、單核細胞增生李斯特菌prfA、副溶血性弧菌tlh和霍亂弧菌ompW4靶基因保守序列設計特異性引物,進行單重PCR擴增和敏感性試驗;優(yōu)化多重PCR反應體系中退火溫度,進行多重PCR特異性、敏感性和人工添加目的菌污染魷魚檢測試驗;建立多重PCR檢測技術(shù).結(jié)果建立優(yōu)化后的多重PCR對4種目標菌的單一或混合基因組DNA進行特異性擴增,而非目標菌金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、小腸耶爾森菌、大腸埃希氏菌、克雷伯氏菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、陰溝腸桿菌等其他菌株的基因組DNA均未見任何條帶;沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和霍亂弧菌的最低檢出限為104cfu/mL,副溶血性弧菌最低檢出限為107cfu/mL.應用多重PCR對人工添加目標菌和非目標菌的魷魚進行檢測,其結(jié)果可信.結(jié)論本研究建立沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌的多重PCR檢測,具有快速、簡便、靈敏、準確等優(yōu)點,可為水產(chǎn)品食源性... 

【文章來源】：北華大學學報(自然科學版). 2020,21(06)

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【部分圖文】：

單重PCR擴增和靈敏度檢測結(jié)果

由圖2可以看出:退火溫度對多重PCR擴增效果的影響很明顯，退火溫度在52～58℃時均能擴增出4條清晰的目的條帶;但溫度在60℃時，沙門氏菌未能擴增出目的片段，其中以退火溫度為54℃(泳道2)時各菌株目的基因的擴增效率稍高，且較均衡，故選擇54℃為該多重PCR的最佳退火溫度．優(yōu)化后的多重PCR反應體系:模板DNA8μL(各個菌DNA模板各2μL),4種引物各2μL,2×Taq Master Mix 14.5μL，總體積45μL．退火溫度54℃45 s．結(jié)束反應，4℃保存，30 min后通過瓊脂糖凝膠紫外成像分析系統(tǒng)記錄并保存．2.3 多重PCR特異性試驗結(jié)果

優(yōu)化后的PCR反應體系通過單管多重PCR檢測4株目的菌特異性，每管加入4種、3種、2種和1種混合基因組DNA，均能擴增出特異性目的片段．見圖3.2.4 多重PCR靈敏度試驗結(jié)果

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3303563