目的建立一種同時(shí)鑒定沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌的多重PCR快速檢測技術(shù),為水產(chǎn)品中食源性病原菌檢測提供新思路.方法基于沙門氏菌inv A基因、單核細(xì)胞增生李斯特菌prfA、副溶血性弧菌tlh和霍亂弧菌ompW4靶基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物,進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增和敏感性試驗(yàn);優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系中退火溫度,進(jìn)行多重PCR特異性、敏感性和人工添加目的菌污染魷魚檢測試驗(yàn);建立多重PCR檢測技術(shù).結(jié)果建立優(yōu)化后的多重PCR對(duì)4種目標(biāo)菌的單一或混合基因組DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增,而非目標(biāo)菌金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、小腸耶爾森菌、大腸埃希氏菌、克雷伯氏菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、陰溝腸桿菌等其他菌株的基因組DNA均未見任何條帶;沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和霍亂弧菌的最低檢出限為104cfu/mL,副溶血性弧菌最低檢出限為107cfu/mL.應(yīng)用多重PCR對(duì)人工添加目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的魷魚進(jìn)行檢測,其結(jié)果可信.結(jié)論本研究建立沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌的多重PCR檢測,具有快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),可為水產(chǎn)品食源性... 

【文章來源】：北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,21(06)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

單重PCR擴(kuò)增和靈敏度檢測結(jié)果

由圖2可以看出:退火溫度對(duì)多重PCR擴(kuò)增效果的影響很明顯，退火溫度在52～58℃時(shí)均能擴(kuò)增出4條清晰的目的條帶;但溫度在60℃時(shí)，沙門氏菌未能擴(kuò)增出目的片段，其中以退火溫度為54℃(泳道2)時(shí)各菌株目的基因的擴(kuò)增效率稍高，且較均衡，故選擇54℃為該多重PCR的最佳退火溫度．優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系:模板DNA8μL(各個(gè)菌DNA模板各2μL),4種引物各2μL,2×Taq Master Mix 14.5μL，總體積45μL．退火溫度54℃45 s．結(jié)束反應(yīng)，4℃保存，30 min后通過瓊脂糖凝膠紫外成像分析系統(tǒng)記錄并保存．2.3 多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系通過單管多重PCR檢測4株目的菌特異性，每管加入4種、3種、2種和1種混合基因組DNA，均能擴(kuò)增出特異性目的片段．見圖3.2.4 多重PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]副溶血性弧菌微滴數(shù)字PCR定量方法的建立[J]. 方佩佩,趙麗青,馬云,王昌軍,唐靜,李正義,賈俊濤,姜英輝.  食品工業(yè)科技. 2018(19)
[2]我國食品微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究進(jìn)展[J]. 董慶利,王海梅,Pradeep K MALAKAR,劉箐,宋筱瑜,田明勝,陸冉冉.  食品科學(xué). 2015(11)
[3]創(chuàng)傷弧菌流行病學(xué)調(diào)查及致病機(jī)制研究現(xiàn)狀[J]. 武靜,劉曉斐,胡成進(jìn).  醫(yī)學(xué)研究雜志. 2015(03)
[4]致病性弧菌的生物學(xué)特性和致病因子研究進(jìn)展[J]. 滕勇勇,王琪,吳雷,姚月嫻,趙德堅(jiān),莫秋華,孫虹.  熱帶醫(yī)學(xué)雜志. 2014(10)
[5]全國肉類及水產(chǎn)品食源性致病菌污染現(xiàn)況[J]. 周虓.  熱帶醫(yī)學(xué)雜志. 2014(03)
[6]美國Bareilly沙門菌和Nchanga沙門菌感染暴發(fā)疫情對(duì)我國影響的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 曹洋,倪大新,涂文校,孟玲,李雷雷,洪志恒,金連梅.  疾病監(jiān)測. 2013(09)
[7]水產(chǎn)品病原菌及其檢測與控制技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 吳燕燕,李鳳霞,李來好.  微生物學(xué)通報(bào). 2009(01)



本文編號(hào)：3303563