生物制藥工藝學(xué)-動(dòng)物細(xì)胞工程制藥ppt
本文關(guān)鍵詞：制藥工藝學(xué)
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這是一個(gè)關(guān)于生物制藥工藝學(xué)-動(dòng)物細(xì)胞工程制藥ppt，主要介紹了第一節(jié) 概述。第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特征。第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求。第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法。第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式。第七節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器。第八節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求。第九節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的制造實(shí)例。第十節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景和展望等等內(nèi)容。歡迎點(diǎn)擊下載！
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第一節(jié) 概述
細(xì)胞工程是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對(duì)人類有用的產(chǎn)品。
細(xì)胞工程的研究?jī)?nèi)容：
真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)，細(xì)胞融合的理論和技術(shù)，細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植的理論和技術(shù)，染色體改造的理論和技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的理論和技術(shù)，細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)，以及將有關(guān)產(chǎn)物提取純化的理論和技術(shù)。
第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特征
一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)
動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)較原核細(xì)胞復(fù)雜得多
各種細(xì)胞有明確的分工
形態(tài)各異
原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之區(qū)別
通常將離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩類
貼壁細(xì)胞（貼壁依賴型）
懸浮細(xì)胞（非貼壁依賴型）
1.貼壁細(xì)胞
細(xì)胞的生長(zhǎng)必須有可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)、增殖。
常見兩種細(xì)胞形態(tài)：
成纖維細(xì)胞型
上皮細(xì)胞型
2. 懸浮細(xì)胞
這類細(xì)胞的生長(zhǎng)不依賴支持物表面，可在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，如血液的淋巴細(xì)胞和用以生產(chǎn)干擾素的Namalwa細(xì)胞等。
細(xì)胞呈圓形。
3. 兼性帖壁細(xì)胞
有些細(xì)胞不嚴(yán)格依賴支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長(zhǎng)；一定條件下，也可以在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)良好地生長(zhǎng)。如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）、小鼠L929細(xì)胞。
二、動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝
動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成
無(wú)機(jī)成分：水、無(wú)機(jī)鹽
有機(jī)成分：蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸
動(dòng)物細(xì)胞的代謝
糖，脂肪和蛋白質(zhì)的代謝分為三個(gè)降解階段
（大分子降解為小分子，小分子代謝產(chǎn)生三個(gè)主要
的中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)）
三、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)
1. 細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)：一般12~48 h
大腸桿菌：20 min
酵母：2 h
2. 細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象:除少數(shù)細(xì)胞可懸浮培養(yǎng)外，大多數(shù)正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)都需要在一定的基質(zhì)（玻璃、塑料等）上貼附，伸展后才能生長(zhǎng)增殖。
接觸抑制：當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，即每個(gè)細(xì)胞與其周圍細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖。此時(shí)若保持充足的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加……
3.正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的:時(shí)間長(zhǎng)短決定于細(xì)胞來(lái)源的種族和年齡
當(dāng)細(xì)胞離體培養(yǎng)開始，稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)傳代后成為有限細(xì)胞系，此時(shí)即使培養(yǎng)條件都很理想，大多數(shù)細(xì)胞也只能生長(zhǎng)有限時(shí)間，經(jīng)若干傳代后會(huì)逐漸死亡，一般不超過(guò)50代。當(dāng)細(xì)胞突變?yōu)楫惐扼w后，該細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成無(wú)限細(xì)胞系，或稱連續(xù)細(xì)胞系，此時(shí)細(xì)胞的壽命是無(wú)限的。
4.動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感
對(duì)理化因素敏感：如滲透壓、pH、離子強(qiáng)度、剪切力、微量元素等。
由細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)決定。
5. 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高
動(dòng)物細(xì)胞：要求非常高！12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無(wú)機(jī)鹽和微量元素、作為主要碳原的葡萄糖以及多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和貼附因子，而且不同種類要求又有變化。
6. 動(dòng)物細(xì)胞蛋白的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同
細(xì)菌蛋白質(zhì)合成部位？
動(dòng)物蛋白質(zhì)合成部位？為什么有糖基化？
核糖體 高爾基體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成部位
既在游離的核糖體上合成（細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白），又在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成（分泌性的和膜中的融合蛋白），多數(shù)為糖蛋白。
糖鏈加接：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中。
蛋白質(zhì)的糖基化與細(xì)胞功能密切相關(guān)。
總結(jié)：動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)
細(xì)胞分裂周期長(zhǎng)
細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附基質(zhì)，存在接觸抑制
正常二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)壽命有限
動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感，培養(yǎng)難度大
動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高
動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同
動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物
缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低
優(yōu)點(diǎn)：分泌胞外、收集純化方便，翻譯后修飾（糖基化），與天然產(chǎn)品一致，更適合臨床使 用。
動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的生物藥物比例越來(lái)越大！
第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得
一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求
二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得
三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選
四、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性
五、細(xì)胞庫(kù)的建立
一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求
二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得
用于生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞：
原代細(xì)胞
已建立的二倍體細(xì)胞系
可無(wú)限期傳代的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系
用這些細(xì)胞進(jìn)行融合和重組的工程細(xì)胞系
1. 原代細(xì)胞
直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過(guò)粉碎、消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。如雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。
用原代細(xì)胞生產(chǎn)生物制品常需要大量的動(dòng)物，費(fèi)錢費(fèi)力。
2. 二倍體細(xì)胞系
原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。
由于該類細(xì)胞壽命有限，一般從動(dòng)物的胚胎組織中獲取。如WI-38、MRC-5、2BS等曾廣泛用于生產(chǎn)。
二倍體細(xì)胞系有正常細(xì)胞的特點(diǎn)
染色體組型是2n核型
貼壁依賴、接觸抑制
可傳代培養(yǎng)50代
無(wú)致瘤性
3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系
通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成，常常由于染色體的斷裂變成了異倍體，失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，獲得了無(wú)限增殖的能力。
轉(zhuǎn)化過(guò)程可以是自發(fā)的、人為的（SV40病毒、化學(xué)試劑）。也可從直接從動(dòng)物的腫瘤組織中建立。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞系具有無(wú)限生命力，常常倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求較低，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero細(xì)胞等。
中國(guó)尚未成立細(xì)胞保存中心，細(xì)胞分散保存在各研究所。
4. 融合細(xì)胞系
細(xì)胞融合：指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。
各種融合：動(dòng)物與動(dòng)物；動(dòng)物與植物；植物與植物。
正常情況下，兩個(gè)接觸的細(xì)胞不融合。在特定誘導(dǎo)物作用下，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生一定變化，導(dǎo)致兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的融合。
細(xì)胞融合方法（誘導(dǎo)法）
仙臺(tái)病毒融合法：已很少使用
聚乙二醇融合法：目前主要用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備
細(xì)胞融合方法（物理法）
電融合法：細(xì)胞在短時(shí)間的電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性的電擊穿，而使相鄰細(xì)胞的細(xì)胞膜相互發(fā)生繼發(fā)性融合。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單（電融合儀），無(wú)化學(xué)毒性、對(duì)細(xì)胞損傷小、融合同步、融合率高，可在顯微鏡下直接觀察。已成功用于多種細(xì)胞的融合。
5. 重組工程細(xì)胞系
采用基因工程的手段構(gòu)建各種工程細(xì)胞。
總結(jié)：原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系仍用于生產(chǎn)中，但生產(chǎn)中采用更多的、更有前景的是融合細(xì)胞和重組工程細(xì)胞。
三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選
1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建
2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程 細(xì)胞株的篩選
1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建
病毒載體：如牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒等。
質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體(在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都能擴(kuò)增)。先在細(xì)菌中構(gòu)建好重組質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞。
桿狀病毒載體
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)載體。
文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，已有1000 余種外源基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功地表達(dá)。
桿狀病毒載體
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)載體。
文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，已有1000 余種外源基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功地表達(dá)。
昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)過(guò)程
外源基因與病毒DNA重組，獲得重組病毒
重組病毒感染細(xì)胞，重組DNA進(jìn)入細(xì)胞
外源基因隨病毒復(fù)制而表達(dá)
桿狀病毒載體
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)載體。
文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，已有1000 余種外源基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功地表達(dá)。
桿狀病毒作載體的優(yōu)點(diǎn)
該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進(jìn)行重組；
插入7~8kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成；
多角體蛋白和病毒粒子的形成無(wú)直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；
多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20~30%；
用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，容易以此為標(biāo)記物來(lái)挑選陽(yáng)性克�。ǘ嘟求w被替代后看不到）；
如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接表達(dá)外源基因。
穿梭質(zhì)粒載體一般含有如下基本成分
允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。
含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件。
能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。
有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。
選擇標(biāo)記有兩種
僅適用于密切相關(guān)的突變細(xì)胞株，如標(biāo)記基因hgprt和tk，分別只適用于hgprt-和tk-基因缺失的細(xì)胞株。
顯性作用基因，如neo，它能使抗生素-新霉素失活，從而使原來(lái)對(duì)新霉素敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞一旦獲得該基因的載體后，就能在含該抗生素的培養(yǎng)基中存活。
穿梭質(zhì)粒載體一般含有如下基本成分
允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。
含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件。
能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。
有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。
選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)
最常用編碼二氫葉酸還原酶（DHFR）的基因。DHFR的擴(kuò)增可防止氨甲蝶呤（MTX）對(duì)細(xì)胞的毒害作用。將DHFR的基因與目的基因一起構(gòu)建到載體中，當(dāng)在培養(yǎng)基內(nèi)增加MTX濃度時(shí)，就會(huì)促使DHFR基因的擴(kuò)增，同時(shí)也會(huì)使毗鄰的目的基因隨之?dāng)U增，從而提高表達(dá)量。
穿梭質(zhì)粒載體一般含有如下基本成分
允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。
含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件。
能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。
有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。
2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選
磷酸鈣沉淀法：將溶解的DNA加在Na2HPO4
中，逐漸加入CaCl2溶液，當(dāng) Na2HPO4和CaCl2形成
沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉
淀物，當(dāng)沉淀物與細(xì)胞表面接觸時(shí)，通過(guò)吞噬作用
將DNA導(dǎo)入胞內(nèi)。
優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單，可進(jìn)行共轉(zhuǎn)化
電穿孔法：借助電穿孔儀產(chǎn)生的高壓脈沖電場(chǎng)，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性的小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。
特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較高，但進(jìn)入的DNA拷貝數(shù)較低
如何篩選工程細(xì)胞？
依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇標(biāo)記采用相應(yīng)的篩選系
統(tǒng)：如用HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）
選擇系統(tǒng)，篩選tk+、hgprt+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；用G418
（Geneticin）選擇系統(tǒng)，篩選neor的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
對(duì)選出的細(xì)胞進(jìn)行克隆和亞克隆使其純化。
利用擴(kuò)增系統(tǒng)，不斷增加其基因拷貝數(shù)，獲得高效表達(dá)而穩(wěn)定的工程細(xì)胞株。
四、常用生產(chǎn)用細(xì)胞的特性
CHO細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢上皮樣細(xì)胞。用于構(gòu)建重組工程細(xì)胞系。
最為成熟和普遍表達(dá)糖基化蛋白藥物的細(xì)胞。
COS細(xì)胞：廣泛用于瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。
SP2/0-Ag14：用于單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備和抗體的生產(chǎn)。
BHK-21細(xì)胞，Vero細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞等。
五、細(xì)胞庫(kù)的建立
用于生產(chǎn)的細(xì)胞（除原代細(xì)胞外）必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：
1. 原始細(xì)胞庫(kù)（master cell bank，MCB）
2. 生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（manugacture’s working cell bank，MWCB),或稱工作細(xì)胞庫(kù)（working cell bank，WCB)。
原始細(xì)胞庫(kù)是單一來(lái)源的均質(zhì)的細(xì)胞，對(duì)于二倍體細(xì)胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。貯存時(shí)須有該細(xì)胞的詳細(xì)檔案，包括：
該細(xì)胞系的歷史：來(lái)源、年齡和性別、細(xì)胞分離的方法、所用的培養(yǎng)材料等；
該細(xì)胞系的特性：形態(tài)、生長(zhǎng)的特性、種源的特性等；
對(duì)各種有害因子檢查的結(jié)果。
生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)：從原始細(xì)胞庫(kù)來(lái)，或從單一安瓿來(lái)，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增到一定數(shù)量后，再分裝儲(chǔ)存形成的細(xì)胞庫(kù)。
生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)也必須建立檔案，而且需要進(jìn)行無(wú)菌性和無(wú)細(xì)胞交叉污染的檢查，生產(chǎn)時(shí)需確定其最高使用的傳代數(shù)。
第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基
培養(yǎng)成功必備條件：
所有與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液，都必須保持 絕對(duì)無(wú)菌，避免細(xì)胞外微生物的污染
必須有足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，絕對(duì)不可有有害的物質(zhì)，避免即使是極微量的有害離子的摻入
保證有適量的氧氣供應(yīng)
需要隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物
有良好的適于生存的外界環(huán)境，如pH、滲透壓、離子濃度等
及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度
一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件
器材的清洗和消毒
水質(zhì)
pH
滲透壓
溫度
空氣
1. 器材的清洗和消毒
（1）器材的清洗：
浸泡（3%磷酸三鈉）
刷洗
泡酸（重鉻酸鉀、硫酸、水）
沖洗（自來(lái)水、蒸餾水、去離子水）
（2）器材的消毒滅菌：
物理方法：如紫外線、干熱、濕熱、過(guò)濾
化學(xué)方法：如化學(xué)消毒劑、抗生素
2. 水質(zhì)
細(xì)胞培養(yǎng)的水必須進(jìn)行特殊的處理，才能使用。
除去微生物、有毒元素、金屬離子、熱原質(zhì)
當(dāng)前處理水質(zhì)的方法有：蒸餾、離子交換、電滲透、反滲透、中空纖維過(guò)濾等
3. pH
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為7.2~7.4，低于6.8或高于7.6會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)可引起細(xì)胞退變甚至死亡。
培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力，必須加入緩沖系統(tǒng)： 如HEPES、Na2HPO4/ NaH2PO4緩沖系統(tǒng)、NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)等。
4. 滲透壓
動(dòng)物細(xì)胞缺乏細(xì)胞壁，外界滲透壓的高低波動(dòng)對(duì)細(xì)胞存活有很大影響。
最理想的滲透壓為290~300mOsm/kg
為調(diào)整培養(yǎng)液的滲透壓，一般采用加減NaCl的方法：
1mg/ml NaCl---32mOsm/kg
在細(xì)胞培養(yǎng)操作中，為保持合適的滲透壓和pH，一般都使用平衡鹽溶液（BBS），由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成。
5. 溫度
動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：37±0.5℃
昆蟲細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：27 ℃
溫度過(guò)高：細(xì)胞退變甚至死亡
溫度過(guò)低：降低代謝和生長(zhǎng)速度，影響產(chǎn)量
6. 空氣
方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)，保持瓶?jī)?nèi)有足夠的空間，即培養(yǎng)的液體量不超過(guò)總體積的30%。
采用生物反應(yīng)器需通氣，采用不同比例的O2、N2、CO2和空氣。
二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成
天然培養(yǎng)基
合成培養(yǎng)基
無(wú)血清培養(yǎng)基
1. 天然培養(yǎng)基
指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。
缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，制作過(guò)程復(fù)雜，組分不穩(wěn)定，批間差異大，來(lái)源有限，不適于大量培養(yǎng)和生產(chǎn)的需要，逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。
2. 合成培養(yǎng)基
用成分明確的化學(xué)試劑配制成的培養(yǎng)基。
優(yōu)點(diǎn)：成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)
其組成大致如下：
單純使用合成培養(yǎng)基，細(xì)胞常常不能很好增殖，甚至不能貼壁。因此在使用時(shí)常常需要加入一定量的動(dòng)物血清，最常用的是5%-10%的動(dòng)物血清。雜瘤細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)血清要求更高，常需10%-20%胎牛血清。
維生素
糖類
無(wú)機(jī)鹽
其它成分
血清的作用機(jī)制
提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的各種生長(zhǎng)因子和激素
提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子
提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白
提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的脂肪酸和微量元素
提供良好的pH緩沖系統(tǒng)
3. 無(wú)血清培養(yǎng)基
無(wú)血清培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+不同種類的添加劑
添加劑大致有以下幾類：
激素和生長(zhǎng)因子：
各種激素、生長(zhǎng)因子的功能
維持細(xì)胞的功能
保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）
使用最多的是胰島素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有刺激作用。
結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補(bǔ)充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。
貼附和伸展因子：目前多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細(xì)胞，真正能用以培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子。
其它有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。
無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：
提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批次之間差異的影響；
減少了由血清帶來(lái)病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；
供應(yīng)充足、穩(wěn)定；
細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；
避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；
減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。
第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法
培養(yǎng)細(xì)胞的種類：
原代細(xì)胞培養(yǎng)
傳代細(xì)胞培養(yǎng)
培養(yǎng)基不同：
液體培養(yǎng)
固體培養(yǎng)
培養(yǎng)容器和方式不同：
靜止培養(yǎng)
旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)
微載體培養(yǎng)
中空纖維培養(yǎng)
固定化培養(yǎng)
一、細(xì)胞分離
離心分離法：主要用于從含有細(xì)胞的體液，如血液、羊水、胸腹水中分離細(xì)胞，800~1000 r/min離心5~10min
消化分離法：將生物體的組織塊剪碎---用消化液消化，使組織松散成細(xì)胞懸液---用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液---獲得所需細(xì)胞
消化液的用途：取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液；傳代培養(yǎng)時(shí)將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)。
常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶、鏈酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等
二、細(xì)胞計(jì)數(shù)
自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)
原理：讓一定體積的細(xì)胞懸液流經(jīng)一個(gè)小孔，并在兩個(gè)電極間通過(guò)，此時(shí)通過(guò)的細(xì)胞就會(huì)對(duì)電極間的電流產(chǎn)生干擾而使電壓發(fā)生改變，這樣就會(huì)在電子計(jì)數(shù)器上形成一個(gè)信號(hào)被記錄下來(lái)。
優(yōu)點(diǎn)：計(jì)數(shù)速度快
缺點(diǎn)：無(wú)法分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞，誤將細(xì)胞結(jié)團(tuán)記錄為單個(gè)細(xì)胞，使計(jì)數(shù)值偏低
血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)
2. 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)
臺(tái)酚藍(lán)染色：死細(xì)胞呈藍(lán)色
苯胺黑染色：負(fù)染色法
結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法
原理：結(jié)晶紫染液屬堿性染料，低滲，有螯合鈣離子的作用，可使細(xì)胞分散解離和破碎，將細(xì)胞核染成藍(lán)色。染色后取樣在血球計(jì)數(shù)板上鏡檢，計(jì)數(shù)細(xì)胞核即細(xì)胞數(shù)。
MTT染色計(jì)數(shù)法
MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。
原理：活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙募着H結(jié)晶，可溶于二甲亞砜（DMSO）。 MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
靈敏度高；MTT有致癌性，DMSO極易滲透皮膚
三、細(xì)胞傳代
懸浮細(xì)胞的傳代：加入一倍或幾倍的生長(zhǎng)液，然后分種兩只或多只培養(yǎng)瓶
貼壁細(xì)胞的傳代：先消化再分種
貼壁細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)
消化前確定細(xì)胞有無(wú)污染
加入消化液量要適當(dāng)，搖動(dòng)時(shí)能蓋滿單層細(xì)胞即可
消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，室溫靜置2-5min
終止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基
分種數(shù)量取決于細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞特性，多數(shù)以20-30萬(wàn)個(gè)/ml，每次1傳2或1傳3為宜；
已培養(yǎng)過(guò)的瓶子可再次使用，但不要超過(guò)2-3次
二倍體細(xì)胞每次傳代時(shí)應(yīng)寫上傳代次數(shù)
傳代后每天或隔一天換液，3-5d傳代一次
四、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇
1. 細(xì)胞的凍存
采用液氮低溫（-196℃）凍存：加保護(hù)劑如甘油和二甲亞砜；冷凍速度以1℃/min的速度下降為宜
注意事項(xiàng)：
凍存前一天換液培養(yǎng)；
細(xì)胞密度以1-2×106個(gè)/ml為宜；
凍存用培養(yǎng)基應(yīng)與實(shí)際使用的一致，DMSO過(guò)濾除菌；
檢查安踣的密封性；
標(biāo)簽要寫上細(xì)胞名稱，編號(hào)和凍存日期。
2.細(xì)胞的復(fù)蘇（總的要求是快融）
注意事項(xiàng)：
操作中注意防護(hù)，戴面罩和手套；
從液氮中取出后，立即丟入37-40℃溫水的搪瓷杯中，并攪動(dòng)加速融化；
用乙醇消毒安踣外表；
盡早除去二甲亞砜，離心，換新鮮培養(yǎng)液；
隔天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，再換液一次。
總結(jié)
動(dòng)物細(xì)胞基本培養(yǎng)方法
細(xì)胞分離
細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞傳代
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式
一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法
二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式
一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法
懸浮培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng) 貼壁-懸浮培養(yǎng)
1. 懸浮培養(yǎng)
懸浮培養(yǎng)：即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。適用于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較單一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。
缺點(diǎn)：細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度較低。
采用通氣攪拌式生物反應(yīng)器或氣升式生物反應(yīng)器。
2. 貼壁培養(yǎng)
貼壁培養(yǎng)：是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法。適用于一切貼壁依賴性細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。
優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞種類廣，較容易采用灌流培養(yǎng)使細(xì)胞達(dá)到高密度。
缺點(diǎn)：操作麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)需先消化，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。
3.貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）
將貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)二者結(jié)合起來(lái)，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的大規(guī)模培養(yǎng)方法。
微載體培養(yǎng)
包埋和微囊培養(yǎng)
結(jié)團(tuán)培養(yǎng)
（1）微載體培養(yǎng)
微載體培養(yǎng)法：將動(dòng)物細(xì)胞吸附于微載體表面，在
培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長(zhǎng)成
單層的培養(yǎng)方法，或稱微珠培養(yǎng)法。
制備微載體的材料主要有：
葡聚糖
明膠
聚苯乙烯
纖維素等
微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：既可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，滿足絕大多數(shù)細(xì)胞的基本要求，又由于載體體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。
理想微載體需具備的條件
微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性；
微載體的材料無(wú)毒性；
微載體的材料是惰性材料；
材料比重為1.030-1.045g/ml；
粒徑60-250µm（溶脹后），大小均一；
具有好的光學(xué)透明性；
基質(zhì)的性質(zhì)是軟性的；
可耐120℃高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌；
經(jīng)簡(jiǎn)單的適當(dāng)處理后，可反復(fù)使用；
原料充分，制作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉。
從固體微載體發(fā)展到多孔微載體：極大增大了供細(xì)胞貼附的比表面積，同時(shí)還適用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。分兩類：
一類在載體內(nèi)加入鈦等金屬，使比重增加，適用于流化床反應(yīng)器。
另一類不加鈦，比重輕，可與固體微載體一樣，用于攪拌罐式反應(yīng)器或氣升式反應(yīng)器。
（2）包埋和微囊培養(yǎng)
包埋法：將細(xì)胞包埋于各種多聚物多孔載體中的方法，有時(shí)包埋的載體較大，又稱為巨載體。
微囊法：由包埋法衍生而來(lái)，將包埋的顆粒經(jīng)液化處理而成為微囊。用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，小分子物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以自由出入半透膜。囊內(nèi)是微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似。
可用于包埋細(xì)胞的載體材料：人工合成的高分子聚合物（聚丙烯酰胺、環(huán)氧樹脂等）、糖類（如纖維素、瓊脂等）、蛋白質(zhì)（如膠原、纖維蛋白等）。
包埋或微囊培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)
包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害。
可以獲得較高的細(xì)胞密度，一般都在107-108個(gè)/ml以上。
當(dāng)控制微囊膜的孔徑后，可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)，從而有利于下游產(chǎn)物的純化。
可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。
（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)
有些正常需要貼附在基質(zhì)表面的細(xì)胞有形成結(jié)團(tuán)的特點(diǎn)。
利用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法培養(yǎng)，可獲得高密度的細(xì)胞。
可加入直徑較小的微粒促進(jìn)結(jié)團(tuán)
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，節(jié)省了用于微載體的成本
二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式
分批式操作
半連續(xù)式操作
灌流式操作
1. 分批式操作
兩種情況：
將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不斷增長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，，或連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。
先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度后，向反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時(shí)間作用后，將反應(yīng)物取出。
2. 半連續(xù)式操作
定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，而且可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。
3. 灌流式操作
定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。
它與半連續(xù)式操作不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)式培養(yǎng)則同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。
該操作方式是近代用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)各種藥品最被推崇的方式。
灌流式操作的優(yōu)點(diǎn)
細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，營(yíng)養(yǎng)條件好，有害代謝廢物濃度低；
可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量；
產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間縮短，可及時(shí)收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；
培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。
第七節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器
一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及其基本結(jié)構(gòu)
二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測(cè)控制系統(tǒng)
生物反應(yīng)器必備條件
制造生物反應(yīng)器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細(xì)胞直接接觸的材料，對(duì)細(xì)胞必須是無(wú)毒性的；
生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能；
密封性能良好，可避免一切外來(lái)的不需要的微生物的污染；
對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，能保持環(huán)境質(zhì)量的均一；
生物反應(yīng)器必備條件
可長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)；
容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無(wú)死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積；
拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修；
設(shè)備成本盡可能低。
動(dòng)物生物反應(yīng)器的規(guī)模
按規(guī)模大小可分為：
實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：＜20L，用于培養(yǎng)工藝的研究;
中試規(guī)模：20~100L，提供一定量的產(chǎn)品，供純化、臨床前的各種檢測(cè)和臨床觀察，也包括進(jìn)一步的工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn);
生產(chǎn)規(guī)模：＞100L，用于生產(chǎn)，提供產(chǎn)品。
一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及其基本結(jié)構(gòu)
攪拌罐式生物反應(yīng)器
是最經(jīng)典和最早被采用的一種動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器，從細(xì)菌發(fā)酵罐借鑒而來(lái)，目前仍是大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞、用以生產(chǎn)各種藥物的主要設(shè)備。有如下特點(diǎn)：
罐體的高徑比一般采用1~1.5：1，利于增大與空氣的接觸面，滿足動(dòng)物細(xì)胞對(duì)氧的需求；培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的罐底為圓形，以避免細(xì)胞和載體沉積在周邊；
為防止攪拌產(chǎn)生的切力損傷細(xì)胞，攪拌速度慢，一般在20~100r/min，故多數(shù)傾向于采用較大的傾斜式槳葉攪拌器或船舶推進(jìn)式槳葉攪拌器；
一般采用無(wú)氣泡通氣系統(tǒng)，以解決由于氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的損傷；
高密度、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)以及提高反應(yīng)器的生產(chǎn)效率考慮，反應(yīng)器常常需要配備有進(jìn)出液體系統(tǒng)，以便進(jìn)行灌流培養(yǎng)，并有使細(xì)胞與培養(yǎng)基分離使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)的裝置。
氣升式生物反應(yīng)器
作用原理： 氣體通過(guò)反應(yīng)器底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流筒，使得到流筒中的液體總體密度低于外部區(qū)域，從而一直上升，導(dǎo)致液體在反應(yīng)器中循環(huán)。
特點(diǎn)：
高徑比大10:1。
氣泡直徑1~2mm
空氣流速0.01~0.06vvm
剪切力小，混合均一
氧和營(yíng)養(yǎng)的傳遞好
有利于設(shè)備的密封
中空纖維式生物反應(yīng)器
是由數(shù)百乃至數(shù)千根中空纖維集束組成的反應(yīng)器，纖維壁厚為50~100m，呈多孔性，內(nèi)層為超濾膜，內(nèi)腔直徑為200 m，兩端用環(huán)氧樹脂等材料將纖維粘和在一起，并使內(nèi)腔開口于外加的塑料圓筒，使形成兩個(gè)隔開的腔。內(nèi)腔用以灌流充以氧氣的培養(yǎng)基，外腔用以培養(yǎng)細(xì)胞。
該反應(yīng)器占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低。不足之處在于：①不能重復(fù)使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測(cè)。
透析袋或膜式生物反應(yīng)器
透析袋或膜式反應(yīng)器，可將細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中有害代謝產(chǎn)物透析或過(guò)濾掉，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)至更高密度，同時(shí)可根據(jù)需要選用不同相對(duì)分子質(zhì)量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內(nèi)或與細(xì)胞分離開。
最簡(jiǎn)單的是將細(xì)胞置于透析袋內(nèi)，并將共懸于一較大的盛有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，然后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，容器內(nèi)的培養(yǎng)基可不斷更換，最后透析袋內(nèi)的密度可達(dá)很高。
三室系統(tǒng)膜反應(yīng)器
室與室之間的膜或采用微孔濾膜（保留細(xì)胞），或采用可截留不同相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的帶不同大小孔徑的超濾膜（保留產(chǎn)物）。
固定床或流化床式生物反應(yīng)器
固定床反應(yīng)器特點(diǎn)：
結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，裝填的材料可以是一切對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、又有利于細(xì)胞貼附的材料，有實(shí)心載體和有孔載體兩類。
實(shí)心載體：細(xì)胞只能生長(zhǎng)在表面，密度不會(huì)太高；但比較經(jīng)濟(jì)，多數(shù)可重復(fù)使用。
有孔載體：細(xì)胞可進(jìn)入載體內(nèi)，可獲得高密度。但當(dāng)載體過(guò)大時(shí)，載體內(nèi)的細(xì)胞常因營(yíng)養(yǎng)物和氧的交換不充分而影響其生長(zhǎng)和代謝。
二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測(cè)控制系統(tǒng)
1、培養(yǎng)過(guò)程中需檢測(cè)的物化參數(shù)
培養(yǎng)過(guò)程中需檢測(cè)的物化參數(shù)：有些需要在線檢測(cè)，如溫度、pH、攪拌速度、溶氧等；有些則需要取樣離線檢測(cè)，如活細(xì)胞數(shù)、氨基酸濃度分析、葡萄糖乳酸和銨離子的檢測(cè)等，有些則需在檢測(cè)后計(jì)算后才能獲得，如細(xì)胞的群體倍增時(shí)間、細(xì)胞的比增長(zhǎng)率、葡萄糖消耗率、乳酸產(chǎn)率、生物反應(yīng)器生產(chǎn)率等。
2、主要參數(shù)的檢測(cè)和控制方法
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)最為重要的參數(shù)
溫度
pH
溶氧
轉(zhuǎn)速
進(jìn)出流液量
第八節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求
一、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品常用的純化方法
二、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求
下游純化工作費(fèi)錢、難度大
成分復(fù)雜：工程細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，常常和細(xì)胞內(nèi)容物、培養(yǎng)基成分，特別當(dāng)采用有血清培養(yǎng)基時(shí)小牛血清中的各種蛋白成分都將與產(chǎn)物混雜在一起，這些成分的物化性質(zhì)常常和目的產(chǎn)物非常相似，因此很難將他們分離開
作用于人體的藥物純度要求高：由于產(chǎn)品多數(shù)用于人體，為防雜質(zhì)對(duì)人體的有害作用，對(duì)產(chǎn)品的純度要求很高，一般在98%以上
大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物產(chǎn)量低，生物活性不穩(wěn)定，因此要求純化過(guò)程中所有的操作都應(yīng)該非常溫和、精細(xì)，包括溶液的溫度、pH和鹽離子強(qiáng)度等都需要嚴(yán)格控制，要有相當(dāng)精密的設(shè)備和檢測(cè)儀器。
由于細(xì)胞產(chǎn)品多種多樣，它們的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量大小和等電點(diǎn)等都不盡相同，因此分離純化技術(shù)的通用性差，必須根據(jù)每一種產(chǎn)品的特點(diǎn)研究開發(fā)出適合于該產(chǎn)品的專用的分離純化技術(shù)。
一、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品常用的純化方法
離心（低溫離心）
離子交換層析
凝膠層析
親和層析
鹽析和有機(jī)溶劑沉淀
透析
高壓液相層析
鹽析和有機(jī)溶劑沉淀
鹽析：溶液中加入無(wú)機(jī)鹽類，破壞蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜，使蛋白質(zhì)溶解度降低而析出。最常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等。調(diào)節(jié)鹽濃度和pH常同時(shí)使用。鹽析時(shí)蛋白不易變性，結(jié)束后需要進(jìn)行透析、超濾脫鹽。
有機(jī)溶劑沉淀：加入與水可混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白質(zhì)沉淀。為了避免蛋白質(zhì)變性必須在低溫下操作。
透析
原理：蛋白質(zhì)分子較大，不能通過(guò)半透膜，可以據(jù)此將蛋白質(zhì)與相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)分開。
高壓液相層析 （HPLC，high-pressure liquid chromatography）
使用顆粒極細(xì)的介質(zhì)，在高壓下分離蛋白質(zhì)或其他分子混合物的層析技術(shù)。
柱效比經(jīng)典柱色譜柱高。在色譜柱出口處常常配以高靈敏度的監(jiān)測(cè)器，以及自動(dòng)描記、分布收集的裝置，并用計(jì)算機(jī)進(jìn)行色譜條件的設(shè)定及數(shù)據(jù)處理。
二、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求
對(duì)工程細(xì)胞的要求：
有細(xì)胞系的歷史資料
有細(xì)胞特性的資料
無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體和各種病毒，包括反轉(zhuǎn)錄病毒等外來(lái)有害因子的污染
生產(chǎn)工藝（細(xì)胞培養(yǎng)和純化工藝）的要求：
對(duì)生產(chǎn)廠房、原材料和試劑的要求
對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的要求
對(duì)純化過(guò)程的要求
對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量要求：
產(chǎn)品純度
產(chǎn)品生物活性
產(chǎn)品比活性：每毫克蛋白質(zhì)中含有多少單位生物學(xué)活性（U/mg）
產(chǎn)品蛋白質(zhì)性質(zhì)的鑒定
產(chǎn)品中雜質(zhì)的檢測(cè)
產(chǎn)品的穩(wěn)定性
產(chǎn)品臨床前的安全性和有效性評(píng)價(jià)
產(chǎn)品臨床試驗(yàn)的安全性和有效性評(píng)價(jià)
第九節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望
一、改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量
二、利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本
三、抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)周期
四、采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量
五、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究
六、組織工程的研究
一、改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量
采用更強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子
更好的利用擴(kuò)增系統(tǒng)或?qū)ふ腋弑磉_(dá)位點(diǎn)
采用和改造更好的宿主細(xì)胞
二、利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本
采用代謝工程改造工程細(xì)胞
代謝工程，即采用基因工程的手段，使工程細(xì)胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，使其降低對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要，減少某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和危害，以及控制工程細(xì)胞的增殖速度和制造產(chǎn)品的能力。
改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本
優(yōu)化培養(yǎng)工藝
三、抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)周期
細(xì)胞凋亡：一種由遺傳基因決定的程序性細(xì)胞主動(dòng)死亡
防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞凋亡的三種措施：①通過(guò)培養(yǎng)基和氧的優(yōu)化供應(yīng)防止?fàn)I養(yǎng)和氧的缺乏；②用化學(xué)添加劑如抗氧化劑等阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程；③采用抗細(xì)胞凋亡基因改造工程細(xì)胞
四、采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量
蛋白質(zhì)有兩種糖基化方式：N-糖基化和O-糖基化。O-糖鏈對(duì)蛋白質(zhì)特性影響不大，N-糖鏈的不同對(duì)產(chǎn)品可產(chǎn)生較大的影響。
糖基化工程：用基因工程的手段，人為的改變肽鏈結(jié)構(gòu)、增加某些酶基因以及改進(jìn)和控制某些培養(yǎng)條件等，以達(dá)到正確糖基化的目的。
五、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究
1982年P(guān)alimiter等首次提出用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)藥用蛋白�，F(xiàn)有α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ和蛋白C等多種產(chǎn)品。
優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)量高、成本低、產(chǎn)品質(zhì)量基本上與天然的一樣
六、組織工程的研究
組織工程：通過(guò)對(duì)細(xì)胞的大量培養(yǎng)，并用細(xì)胞直接作為一種治療手段用于臨床，或用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)一步加工構(gòu)成一種組織，如人造皮膚、人造肝臟、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于臨床治療。
第三章 總結(jié)
動(dòng)物細(xì)胞的生理特性（識(shí)記和理解）
動(dòng)物細(xì)胞的人工培養(yǎng)方法（識(shí)記和理解）
動(dòng)物細(xì)胞工程反應(yīng)器：攪拌罐式反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器、中空纖維式反應(yīng)器和固定床和流化床式反應(yīng)器
本文編號(hào)：1255668
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