本文關(guān)鍵詞：菌絲霉素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其對(duì)大鼠腸道健康和免疫功能的影響

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【摘要】：飼料中添加抗生素可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、對(duì)某些疾病起預(yù)防和治療作用,但抗生素的應(yīng)用也帶來(lái)了耐藥性和殘留等負(fù)面效應(yīng),因此其替代品的研發(fā)成為目前的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽因其無(wú)耐藥性且具有良好的抑菌效果而逐漸受到人們的關(guān)注。菌絲霉素(Ple)是2005年Mygind等人從腐生子囊菌分泌蛋白中篩選分離得到的首例真菌防御素,具有強(qiáng)烈的抗革蘭氏陽(yáng)性菌作用。但是由于從天然菌株中分離菌絲霉素工藝復(fù)雜,且成本較高,限制了其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)菌絲霉素的廉價(jià)生產(chǎn),本研究成功構(gòu)建了可分泌表達(dá)Ple的畢赤酵母基因工程菌,研究了重組表達(dá)產(chǎn)物的體外抑菌活性和穩(wěn)定性；在此基礎(chǔ)上初步評(píng)價(jià)其在動(dòng)物試驗(yàn)中的應(yīng)用效果。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：試驗(yàn)一：菌絲霉素多聚體基因在畢赤酵母中的表達(dá)為提高Ple基因的表達(dá)量,降低其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主的毒性,本研究室在前期研究中構(gòu)建了Ple多聚體基因,并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。為進(jìn)一步提高重組Ple表達(dá)水平,本試驗(yàn)將Ple多聚體基因克隆進(jìn)入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA,轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33后得到一株基因工程菌PPle：在1%甲醇誘導(dǎo)下,其表達(dá)產(chǎn)物Ple能夠有效分泌至培養(yǎng)基中,重組菌絲霉素分子大小約為41 kDa；在搖瓶中誘導(dǎo),畢赤酵母基因工程菌PPle分泌水平達(dá)143μg/mL.該畢赤酵母工程菌的成功構(gòu)建為進(jìn)一步評(píng)估其抑菌效果奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)二：重組菌絲霉素分離純化及體外抑菌活性研究為了初步探討重組菌絲霉素的抑菌活性,將畢赤酵母基因工程菌PPle在搖瓶中誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)His標(biāo)簽純化,并進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明,本試驗(yàn)獲得的重組菌絲霉素對(duì)豬鏈球菌和金黃葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有強(qiáng)烈的抑制作用；最小抑菌濃度顯示菌絲霉素對(duì)豬鏈球菌最為敏感,最小抑菌濃度為4 μg/mL：重組菌絲霉素能從pH 2.0到10.0保持抗菌活性,且經(jīng)胃蛋白酶消化處理后仍能保持較強(qiáng)的抑菌活性。上述研究結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的重組菌絲霉素抗菌肽具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,具有替代抗生素在動(dòng)物生產(chǎn)上應(yīng)用的潛力。試驗(yàn)三：重組菌絲霉素抗菌肽對(duì)大鼠腸道健康和免疫功能的影響為了考察重組Ple對(duì)大鼠腸道健康、免疫功能的影響,評(píng)估其在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)采用2×3因子設(shè)計(jì),60只4周齡健康SD大鼠,按體重相近、雌雄各半的原則,隨機(jī)分為6個(gè)處理(n=10),單籠飼養(yǎng)。大鼠分別通過(guò)腹腔連續(xù)注射重組Ple、萬(wàn)古霉素和培養(yǎng)上清液(對(duì)照)后。對(duì)其中一半大鼠進(jìn)行金黃色葡萄球菌攻毒(另一半作為對(duì)照注射無(wú)菌生理鹽水),所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2周后宰殺取樣。結(jié)果表明：金黃色葡萄球菌攻毒對(duì)大鼠免疫器官指數(shù)無(wú)顯著影響,但大鼠血清IgA和IgM含量有降低的趨勢(shì)(0.05P0.10),腹腔注射菌絲霉素和萬(wàn)古霉素均能提高大鼠血清免疫球蛋白含量,改善大鼠免疫機(jī)能；攻毒導(dǎo)致大鼠十二指腸絨毛高度下降、sIgA含量減少,盲腸金黃色葡萄球菌含量顯著增加(P0.05),但注射菌絲霉素可緩解上述負(fù)面影響,其效果優(yōu)于萬(wàn)古霉素。綜上所述,本研究成功實(shí)現(xiàn)了Ple多聚體基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)；其表達(dá)產(chǎn)物(重組Ple)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌特別是豬鏈球菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用；重組菌絲霉素可改善大鼠免疫功能和腸道健康,并在一定程度上替代萬(wàn)古霉素用于金黃色葡萄球菌感染的預(yù)防和治療,有望成為一種潛在的抗生素替代品應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)。
【關(guān)鍵詞】：菌絲霉素 多聚體 純化 畢赤酵母 抑菌活性 大鼠 腸道健康 免疫功能
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S816
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 本文詞語(yǔ)縮寫(xiě)9-14
• 引言14-15
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述15-24
• 第一節(jié) 抗生素替代品研究現(xiàn)狀15-17
• 1. 益生菌15
• 2. 酸化劑15-16
• 3. 酶制劑16
• 4. 抗菌肽16-17
• 5. 其它抗生素替代品17
• 第二節(jié) 菌絲霉素抗菌肽17-21
• 1. 菌絲霉素結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系17-19
• 2. 菌絲霉素的生化性質(zhì)19-20
• 3. 菌絲霉素的生物學(xué)活性20-21
• 第三節(jié) 菌絲霉素抑菌機(jī)理及其生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀21-24
• 1. 菌絲霉素抑菌機(jī)理22-23
• 1.1 胞膜攻擊作用22
• 1.2 細(xì)胞壁生成的抑制作用22
• 1.3 酶活抑制作用22-23
• 2. 菌絲霉素生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀23-24
• 2.1 生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀23
• 2.2 存在的問(wèn)題23-24
• 第二部分 本研究的目的、內(nèi)容、意義與技術(shù)路線24-26
• 1. 研究目的24
• 2. 研究?jī)?nèi)容24
• 3. 研究的意義24
• 4. 研究的技術(shù)路線24-26
• 第三部分 試驗(yàn)研究26-59
• 試驗(yàn)一 Ple多聚體基因在畢赤酵母中的表達(dá)26-41
• 1. 試驗(yàn)材料26-29
• 2. 試驗(yàn)方法29-35
• 2.1 重組質(zhì)粒pMD19-T-Ple的抽提29
• 2.2 核酸電泳29
• 2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T-Ple的雙酶切29-30
• 2.4 Ple多聚體基因酶切產(chǎn)物回收30
• 2.5 表達(dá)載體pPICZαA雙酶切30
• 2.6 DNA連接反應(yīng)30-31
• 2.7 大腸桿菌DH5α感受態(tài)制作與轉(zhuǎn)化31
• 2.8 陽(yáng)性轉(zhuǎn)換子篩選31-32
• 2.9 表達(dá)載體pPICZαA-Ple大量制備32
• 2.10 表達(dá)載體pPICZαA-Ple線性化32
• 2.11 畢赤酵母X-33感受態(tài)制備32-33
• 2.12 畢赤酵母X-33電擊轉(zhuǎn)化33
• 2.13 酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)和篩選33
• 2.14 酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)培養(yǎng)33-34
• 2.15 蛋白濃度測(cè)定34
• 2.16 SDS-PAGE檢測(cè)34-35
• 3. 試驗(yàn)結(jié)果35-39
• 3.1 Ple多聚體基因的擴(kuò)增35-36
• 3.2 畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-Ple的構(gòu)建36
• 3.3 畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-Ple線性化36-37
• 3.4 電轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆子的篩選37-38
• 3.5 畢赤酵母基因工程菌PPle的誘導(dǎo)表達(dá)38-39
• 4. 討論39-40
• 5. 小結(jié)40-41
• 試驗(yàn)二 重組菌絲霉素分離純化及體外抑菌活性的研究41-48
• 1. 試驗(yàn)材料41
• 2. 試驗(yàn)方法41-43
• 2.1 基因工程菌PPle小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)41-42
• 2.2 重組菌絲霉素的超濾濃縮42
• 2.3 重組菌絲霉素純化42
• 2.4 SDS-PAGE檢測(cè)42
• 2.5 重組菌絲霉素體外抑菌活性檢測(cè)42
• 2.6 重組菌絲霉素的最小抑菌濃度42-43
• 2.7 重組菌絲霉素穩(wěn)定性分析43
• 3. 試驗(yàn)結(jié)果43-46
• 3.1 重組菌絲霉素的純化43-44
• 3.2 體外抑菌活性研究44-45
• 3.3 最小抑菌濃度45-46
• 3.4 pH和消化酶對(duì)重組菌絲霉素活性影響46
• 4. 討論46-47
• 5. 小結(jié)47-48
• 試驗(yàn)三 重組菌絲霉素對(duì)大鼠腸道健康和免疫功能的影響48-59
• 1. 試驗(yàn)材料48
• 2. 試驗(yàn)方法48-52
• 2.1 重組菌絲霉素的制備與純化48
• 2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和動(dòng)物飼養(yǎng)管理48-49
• 2.3 樣品采集49
• 2.4 考察指標(biāo)及測(cè)定方法49-52
• 3. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析52
• 4. 試驗(yàn)結(jié)果52-57
• 4.1 重組菌絲霉素對(duì)大鼠免疫器官指數(shù)和血清免疫指標(biāo)的影響52-53
• 4.2 菌絲霉素對(duì)大鼠腸黏膜形態(tài)和分泌型免疫球蛋白A的影響53
• 4.3 菌絲霉素對(duì)大鼠回腸、盲腸微生物菌群的影響53-57
• 5. 討論57-58
• 6. 小結(jié)58-59
• 第四部分 全文結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題59-61
• 一、結(jié)論59
• 二、本文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)59
• 三、有待進(jìn)一步解決的問(wèn)題59-61
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 致謝70-71
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章71

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本文編號(hào)：758186