本文關鍵詞：菌絲霉素在畢赤酵母中的分泌表達及其對大鼠腸道健康和免疫功能的影響

  更多相關文章： 菌絲霉素 多聚體 純化 畢赤酵母 抑菌活性 大鼠 腸道健康 免疫功能

【摘要】：飼料中添加抗生素可促進動物生長、提高飼料轉化率、對某些疾病起預防和治療作用,但抗生素的應用也帶來了耐藥性和殘留等負面效應,因此其替代品的研發(fā)成為目前的研究熱點。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽因其無耐藥性且具有良好的抑菌效果而逐漸受到人們的關注。菌絲霉素(Ple)是2005年Mygind等人從腐生子囊菌分泌蛋白中篩選分離得到的首例真菌防御素,具有強烈的抗革蘭氏陽性菌作用。但是由于從天然菌株中分離菌絲霉素工藝復雜,且成本較高,限制了其應用。為實現(xiàn)菌絲霉素的廉價生產(chǎn),本研究成功構建了可分泌表達Ple的畢赤酵母基因工程菌,研究了重組表達產(chǎn)物的體外抑菌活性和穩(wěn)定性；在此基礎上初步評價其在動物試驗中的應用效果。主要研究內(nèi)容和結果如下：試驗一：菌絲霉素多聚體基因在畢赤酵母中的表達為提高Ple基因的表達量,降低其表達產(chǎn)物對宿主的毒性,本研究室在前期研究中構建了Ple多聚體基因,并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達。為進一步提高重組Ple表達水平,本試驗將Ple多聚體基因克隆進入畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαA,轉化畢赤酵母X-33后得到一株基因工程菌PPle：在1%甲醇誘導下,其表達產(chǎn)物Ple能夠有效分泌至培養(yǎng)基中,重組菌絲霉素分子大小約為41 kDa；在搖瓶中誘導,畢赤酵母基因工程菌PPle分泌水平達143μg/mL.該畢赤酵母工程菌的成功構建為進一步評估其抑菌效果奠定了基礎。試驗二：重組菌絲霉素分離純化及體外抑菌活性研究為了初步探討重組菌絲霉素的抑菌活性,將畢赤酵母基因工程菌PPle在搖瓶中誘導的表達產(chǎn)物通過His標簽純化,并進行體外抑菌試驗。結果表明,本試驗獲得的重組菌絲霉素對豬鏈球菌和金黃葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有強烈的抑制作用；最小抑菌濃度顯示菌絲霉素對豬鏈球菌最為敏感,最小抑菌濃度為4 μg/mL：重組菌絲霉素能從pH 2.0到10.0保持抗菌活性,且經(jīng)胃蛋白酶消化處理后仍能保持較強的抑菌活性。上述研究結果表明,本實驗室研發(fā)的重組菌絲霉素抗菌肽具有較強的穩(wěn)定性,具有替代抗生素在動物生產(chǎn)上應用的潛力。試驗三：重組菌絲霉素抗菌肽對大鼠腸道健康和免疫功能的影響為了考察重組Ple對大鼠腸道健康、免疫功能的影響,評估其在動物生產(chǎn)上的應用前景。本試驗采用2×3因子設計,60只4周齡健康SD大鼠,按體重相近、雌雄各半的原則,隨機分為6個處理(n=10),單籠飼養(yǎng)。大鼠分別通過腹腔連續(xù)注射重組Ple、萬古霉素和培養(yǎng)上清液(對照)后。對其中一半大鼠進行金黃色葡萄球菌攻毒(另一半作為對照注射無菌生理鹽水),所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2周后宰殺取樣。結果表明：金黃色葡萄球菌攻毒對大鼠免疫器官指數(shù)無顯著影響,但大鼠血清IgA和IgM含量有降低的趨勢(0.05P0.10),腹腔注射菌絲霉素和萬古霉素均能提高大鼠血清免疫球蛋白含量,改善大鼠免疫機能；攻毒導致大鼠十二指腸絨毛高度下降、sIgA含量減少,盲腸金黃色葡萄球菌含量顯著增加(P0.05),但注射菌絲霉素可緩解上述負面影響,其效果優(yōu)于萬古霉素。綜上所述,本研究成功實現(xiàn)了Ple多聚體基因在畢赤酵母中的分泌表達；其表達產(chǎn)物(重組Ple)對革蘭氏陽性菌特別是豬鏈球菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用；重組菌絲霉素可改善大鼠免疫功能和腸道健康,并在一定程度上替代萬古霉素用于金黃色葡萄球菌感染的預防和治療,有望成為一種潛在的抗生素替代品應用于動物生產(chǎn)。
【關鍵詞】：菌絲霉素 多聚體 純化 畢赤酵母 抑菌活性 大鼠 腸道健康 免疫功能
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S816
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 本文詞語縮寫9-14
• 引言14-15
• 第一部分 文獻綜述15-24
• 第一節(jié) 抗生素替代品研究現(xiàn)狀15-17
• 1. 益生菌15
• 2. 酸化劑15-16
• 3. 酶制劑16
• 4. 抗菌肽16-17
• 5. 其它抗生素替代品17
• 第二節(jié) 菌絲霉素抗菌肽17-21
• 1. 菌絲霉素結構與功能的關系17-19
• 2. 菌絲霉素的生化性質19-20
• 3. 菌絲霉素的生物學活性20-21
• 第三節(jié) 菌絲霉素抑菌機理及其生產(chǎn)應用現(xiàn)狀21-24
• 1. 菌絲霉素抑菌機理22-23
• 1.1 胞膜攻擊作用22
• 1.2 細胞壁生成的抑制作用22
• 1.3 酶活抑制作用22-23
• 2. 菌絲霉素生產(chǎn)應用現(xiàn)狀23-24
• 2.1 生產(chǎn)應用現(xiàn)狀23
• 2.2 存在的問題23-24
• 第二部分 本研究的目的、內(nèi)容、意義與技術路線24-26
• 1. 研究目的24
• 2. 研究內(nèi)容24
• 3. 研究的意義24
• 4. 研究的技術路線24-26
• 第三部分 試驗研究26-59
• 試驗一 Ple多聚體基因在畢赤酵母中的表達26-41
• 1. 試驗材料26-29
• 2. 試驗方法29-35
• 2.1 重組質粒pMD19-T-Ple的抽提29
• 2.2 核酸電泳29
• 2.3 重組質粒pMD19-T-Ple的雙酶切29-30
• 2.4 Ple多聚體基因酶切產(chǎn)物回收30
• 2.5 表達載體pPICZαA雙酶切30
• 2.6 DNA連接反應30-31
• 2.7 大腸桿菌DH5α感受態(tài)制作與轉化31
• 2.8 陽性轉換子篩選31-32
• 2.9 表達載體pPICZαA-Ple大量制備32
• 2.10 表達載體pPICZαA-Ple線性化32
• 2.11 畢赤酵母X-33感受態(tài)制備32-33
• 2.12 畢赤酵母X-33電擊轉化33
• 2.13 酵母轉化子培養(yǎng)和篩選33
• 2.14 酵母陽性轉化子的誘導培養(yǎng)33-34
• 2.15 蛋白濃度測定34
• 2.16 SDS-PAGE檢測34-35
• 3. 試驗結果35-39
• 3.1 Ple多聚體基因的擴增35-36
• 3.2 畢赤酵母表達載體pPICZαA-Ple的構建36
• 3.3 畢赤酵母表達載體pPICZαA-Ple線性化36-37
• 3.4 電轉化和陽性克隆子的篩選37-38
• 3.5 畢赤酵母基因工程菌PPle的誘導表達38-39
• 4. 討論39-40
• 5. 小結40-41
• 試驗二 重組菌絲霉素分離純化及體外抑菌活性的研究41-48
• 1. 試驗材料41
• 2. 試驗方法41-43
• 2.1 基因工程菌PPle小規(guī)模誘導培養(yǎng)41-42
• 2.2 重組菌絲霉素的超濾濃縮42
• 2.3 重組菌絲霉素純化42
• 2.4 SDS-PAGE檢測42
• 2.5 重組菌絲霉素體外抑菌活性檢測42
• 2.6 重組菌絲霉素的最小抑菌濃度42-43
• 2.7 重組菌絲霉素穩(wěn)定性分析43
• 3. 試驗結果43-46
• 3.1 重組菌絲霉素的純化43-44
• 3.2 體外抑菌活性研究44-45
• 3.3 最小抑菌濃度45-46
• 3.4 pH和消化酶對重組菌絲霉素活性影響46
• 4. 討論46-47
• 5. 小結47-48
• 試驗三 重組菌絲霉素對大鼠腸道健康和免疫功能的影響48-59
• 1. 試驗材料48
• 2. 試驗方法48-52
• 2.1 重組菌絲霉素的制備與純化48
• 2.2 試驗設計和動物飼養(yǎng)管理48-49
• 2.3 樣品采集49
• 2.4 考察指標及測定方法49-52
• 3. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析52
• 4. 試驗結果52-57
• 4.1 重組菌絲霉素對大鼠免疫器官指數(shù)和血清免疫指標的影響52-53
• 4.2 菌絲霉素對大鼠腸黏膜形態(tài)和分泌型免疫球蛋白A的影響53
• 4.3 菌絲霉素對大鼠回腸、盲腸微生物菌群的影響53-57
• 5. 討論57-58
• 6. 小結58-59
• 第四部分 全文結論、創(chuàng)新點與有待進一步研究的問題59-61
• 一、結論59
• 二、本文主要創(chuàng)新點59
• 三、有待進一步解決的問題59-61
• 參考文獻61-70
• 致謝70-71
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章71

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5 張軍;真菌防御素——菌絲霉素遺傳進化分析，多拷貝表達及其抗菌特性[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2010年

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本文編號：758186