本文關(guān)鍵詞：基因Ⅳ型HEVpORF3在L02細(xì)胞中的表達(dá)研究

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【摘要】：戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是戊型肝炎(hepatitis E, HE)的病原體,可以引起主要由腸道傳播的急性傳染性戊肝�；颌粜虷EV可以感染人和動(dòng)物,其基因組結(jié)構(gòu)與基因Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型相差較大。HEV包括3個(gè)開放讀碼框(open reading frame, ORF),其中ORF3編碼的小分子蛋白與細(xì)胞信號調(diào)控密切相關(guān)。HEV感染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題,在亞洲和非洲的發(fā)病情況尤為嚴(yán)重�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)共有26種,可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破組織屏障作用進(jìn)而侵襲周圍組織。組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)是MMP的天然抑制物,在人體內(nèi)有4種。關(guān)于HEV ORF3對L02細(xì)胞MMP相關(guān)蛋白表達(dá)影響的分子機(jī)制的研究,可以為HEV與肝癌發(fā)生可能存在的關(guān)系的闡釋奠定一定的研究基礎(chǔ)。 本研究中的實(shí)驗(yàn)一通過PCR從pET42a-ORF3中克隆出基因Ⅳ型HEV ORF3基因,構(gòu)建了pEGFP-ORF3和pEGFP慢病毒載體；并運(yùn)用慢病毒包裝試劑盒將上述慢病毒載體在293T細(xì)胞內(nèi)包裝成病毒顆粒；后將病毒顆粒感染L02細(xì)胞,篩選單克隆細(xì)胞,使得pEGFP-ORF3和pEGFP在L02細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)二運(yùn)用蛋白(?)片技術(shù)對比分析了穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-ORF3和穩(wěn)定表達(dá)pEGFP的的L02細(xì)胞的MMP表達(dá)譜,篩選出表達(dá)水平上調(diào)／下調(diào)的基質(zhì)金屬蛋白酶。結(jié)果表明,在穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-ORF3的L02細(xì)胞中,TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4表達(dá)水平均降低。研究結(jié)果為戊型肝炎病毒pORF3對L02細(xì)胞MMP相關(guān)蛋白表達(dá)影響的分子機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：戊型肝炎 L02細(xì)胞 慢病毒轉(zhuǎn)染 蛋白芯片 基質(zhì)金屬蛋白酶
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第一章 文獻(xiàn)綜述8-22
• 1 HEV分子病毒學(xué)8-11
• 2 HEV流行病學(xué)11-13
• 2.1 HEV傳染源11-12
• 2.2 HEV傳播途徑12-13
• 2.3 HEV易感人群13
• 3 HE臨床表現(xiàn)及診斷13-18
• 3.1 HE臨床癥狀13-14
• 3.2 HE特殊類型14-16
• 3.3 HE病理變化16
• 3.4 HE的診斷16-18
• 4 HE治療及預(yù)防18-21
• 5 HE研究現(xiàn)狀和展望21-22
• 第二章 穩(wěn)定表達(dá)SHEV ORF3基因的L02細(xì)胞系的建立22-40
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 1.2 細(xì)胞和菌種22
• 1.3 主要試劑和載體22-23
• 1.4 主要儀器23
• 1.5 主要溶液配制方法23-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-34
• 2.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立25-31
• 2.1.1 L02細(xì)胞的培養(yǎng)25-27
• 2.1.2 慢病毒載體的構(gòu)建27-29
• 2.1.3 慢病毒包裝29-30
• 2.1.4 慢病毒液滴度測定30
• 2.1.5 慢病毒感染L02細(xì)胞30-31
• 2.1.6 穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選31
• 2.2 穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定31-34
• 2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定31
• 2.2.2 考馬斯亮藍(lán)染色鑒定31-33
• 2.2.3 Western blotting鑒定33-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-38
• 3.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立34-36
• 3.1.1 慢病毒包裝34
• 3.1.2 慢病毒濃縮液滴度測定34-35
• 3.1.3 慢病毒感染效率35-36
• 3.2 穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定36-38
• 3.2.1 單克隆細(xì)胞的鑒定36-37
• 3.2.2 穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定37-38
• 4 討論38-40
• 第三章 SHEV ORF3對L02細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)的影響40-47
• 1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 1.2 細(xì)胞40
• 1.3 主要試劑和載體40
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器40-41
• 1.5 主要溶液配制方法41
• 2 實(shí)驗(yàn)方法41-43
• 2.1 收取蛋白樣品41-42
• 2.2 Western blotting實(shí)驗(yàn)42
• 2.3 蛋白芯片分析42-43
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-45
• 3.1 Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果43
• 3.2 蛋白芯片分析結(jié)果43-45
• 4 討論45-47
• 第四章 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-56
• 致謝56

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭蒔雨;基因Ⅳ型HEVpORF3在L02細(xì)胞中的表達(dá)研究[D];海南大學(xué);2015年

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本文編號：757021