本文關鍵詞：山羊GSK-3β基因不同轉錄本的分離鑒定及表達模式研究

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【摘要】：糖原合成酶激酶-3(Glycogen Synthase Kinase-3)是一種通過自身磷酸化與去磷酸化對下游底物起到調控作用的絲/蘇氨酸類蛋白激酶。GSK-3參與調控多種生物學信號通路,如包括Wnt、Hedgehog和IGF-1信號通路等,調控糖原合成、調節(jié)細胞分化增殖、細胞形態(tài)發(fā)育、細胞有絲分裂、肌肉和脂肪細胞增殖分化等多個方面有,在多個領域有重要的研究價值。在哺乳動物中,GSK-3基因有兩個亞型GSK-3α和GSK-3β,隨著研究深入,在人、小鼠和豬還發(fā)現存在GSK-3β基因的多個轉錄本形式。在家畜動物中對于GSK-3β基因的研究還比較少,并且關于山羊GSK-3β基因的不同轉錄本的研究還未見報道。本試驗以我國第一個培育的肉羊品種南江黃羊為試驗材料,利用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR).分子克隆、實時熒光定量(qPCR)以及蛋白免疫印跡法(western blotting)等試驗技術,成功克隆了山羊GSK-3β基因,并分離出山羊GSK-3β基因的多種轉錄本形式,并進一步從mRNA水平和蛋白水平對不同GSK-3β轉錄本在山羊不同組織中的表達情況進行研究,最后成功構建蛋白表達載體,具體結果如下：1.本次試驗成功克隆得到山羊GSK-3β基因的編碼區(qū)全序列,并且在山羊中發(fā)現了GSK-3β的六個不同轉錄本。山羊GSK-3β基因序列與綿羊、牛、豬等哺乳動物的具有很高的一致性,GSK-3β氨基酸序列在哺乳動物中上高度保守。山羊GSK-3β5轉錄本中存在外顯子Exon 8b的插入,該基因序列在人,鼠和豬的研究中均有發(fā)現,且序列完全一致。本實驗中首次報道了新的剪切轉錄形式GSK-3β2, GSK-3β4和GSK-3β6,在GSK-3β6中發(fā)現新的特異型外顯子序列Exon 10b�；蛐蛄刑峤恢罭CBI,登錄號分別為KJ649149-KJ649154。2.利用實時熒光定量PCR(qPCR)技術檢測了山羊GSK-3β六個轉錄本基因在120日齡南江黃羊7個不同組織中的相對表達量。結果顯示GSK-3β基因在山羊的心肌和大腦中有較高水平的表達(P0.01),在肝臟和腎臟中表達量相對較低。山羊GSK-3β不同轉錄本在脾臟、背最長肌和子宮中表達模式存在差異,且差異顯著。3.使用蛋白免疫印跡方法檢測山羊GSK-3β蛋白在7個不同組織中的表達情況�？贵w特異性地識別了兩個分子量大小有一定差異的蛋白條帶。其中,在蛋白分子量為47kDa的位置,GSK-3β在心肌、大腦和背最長肌中表達水平較高,而在肝臟、脾臟和腎臟組織中的表達微弱；在蛋白分子量小于47kDa位置的條帶中,心臟、脾臟、大腦、背最長肌和子宮組織中均可以檢測到GSK-3β蛋白的表達,腎臟中表達量相對較低,肝臟中檢測不到GSK-3β的蛋白表達。4.本研究成功構建了山羊GSK-3β六個轉錄本的表達載體。分別將山羊GSK-3β不同轉錄本有差異的基因序列連接到含有Flag蛋白標簽的RT-Flag-31載體上,并通過酶切驗證,分子克隆及菌液測序驗證,證明載體構建的成功。該載體可用于下一步對羊GSK-3p不同轉錄本的蛋白表達及相關生物學功能的驗證。
【關鍵詞】：山羊 GSK-3β 轉錄本 組織表達 載體構建
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 符號說明9-13
• 1 文獻綜述13-21
• 1.1 GSK-3的基本概況13
• 1.2 GSK-3結構與調控13-14
• 1.3 GSK-3參與調控的重要信號通路研究14-16
• 1.4 GSK-3β對動物肌肉發(fā)育的調控作用研究16-18
• 1.5 GSK-3參與動物糖原代謝過程研究18-19
• 1.6 GSK-3不同亞型的功能研究進展19-20
• 1.7 本研究的目的與意義20-21
• 2 材料與方法21-37
• 2.1 試驗材料組織樣品21
• 2.2 主要儀器設備與試劑21-25
• 2.2.1 主要儀器21-22
• 2.2.2 主要試劑及相關配制22-25
• 2.3 試驗方法25-37
• 2.3.1 實驗樣品的制備25
• 2.3.2 RNA的提取25-26
• 2.3.3 RNA的反轉錄(cDNA鏈反轉錄合成)26-27
• 2.3.4 山羊GSK-3β基因全序列的引物設計及合成27
• 2.3.5 RT-PCR擴增27-28
• 2.3.6 PCR產物膠回收28
• 2.3.7 目的基因的克隆28-29
• 2.3.8 生物信息學分析29-30
• 2.3.9 GSK-3β基因不同轉錄本的表達30
• 2.3.10 qPCR定量30-32
• 2.3.11 蛋白免疫印跡32-36
• 2.3.12 載體構建36-37
• 3 結果與分析37-50
• 3.1 山羊GSK-3β基因的克隆37-38
• 3.1.1 RNA質量檢測37-38
• 3.1.2 PCR擴增檢測結果38
• 3.2 山羊GSK-3β基因不同轉錄本的篩選38-39
• 3.3 菌液測序結果及核酸序列對比分析39-41
• 3.4 山羊GSK-3β基因不同轉錄本的RT-PCR驗證41
• 3.5 氨基酸序列及蛋白結構預測分析41-45
• 3.5.1 氨基酸序列及蛋白預測結果41-43
• 3.5.2 蛋白功能域預測分析43-44
• 3.5.3 GSK-3β氨基酸序列的系統進化分析44-45
• 3.6 GSK-3β不同轉錄本mRNA水平的相對定量分析45-48
• 3.6.1 最適退火溫度的選擇及擴增標準曲線的繪制45-46
• 3.6.2 山羊GSK-3β基因不同轉錄本在各組織中的表達46-48
• 3.7 GSK-3β蛋白在山羊不同組織中的表達研究48-49
• 3.8 山羊GSK-3β不同真核轉錄本載體的構建49-50
• 4 討論50-55
• 4.1 山羊GSK-3β基因不同轉錄本的分子克隆及生物信息學分析50-52
• 4.2 山羊GSK-3β不同轉錄本的蛋白功能域預測與蛋白免疫印跡結果分析52-53
• 4.3 山羊GSK-3β基因及蛋白的組織表達規(guī)律53-54
• 4.4 展望54-55
• 5 結論55-56
• 參考文獻56-63
• 研究生期間論文發(fā)表情況63-65
• 致謝65

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本文編號：707303