本文關(guān)鍵詞：表達水泡性口炎病毒G蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與免疫原性分析

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【摘要】：水泡性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV))引起的高度接觸性人畜共患的重大傳染性疫病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定通報傳染病,也是《中華人民共和國進出境動植物檢疫法》規(guī)定的進境動物二類傳染病。目前,該病還沒有有效的治療方法,只能通過疫苗進行防控。在疫苗研究方面,國內(nèi)外已有一些研究,但新型疫苗的研究有待進一步開發(fā)。VSV糖蛋白(G)定位在包膜的突起上,刺激機體產(chǎn)生中和抗體,呈現(xiàn)型乃至株的特異性,是研究VSV基因工程疫苗的首選抗原。本研究利用人5型復(fù)制缺陷型腺病毒為表達載體,構(gòu)建了表達VSV單一血清型的G蛋白及兩血清型G蛋白融合蛋白的重組腺病毒,并對其免疫原性進行了初步分析。本研究設(shè)計了三對分別擴增VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因的特異性引物,利用PCR技術(shù)擴增VSV-IN-G基因及VSV-NJ-G基因;通過GlyGlyGlyGlySer多肽序列的連接,利用融合PCR技術(shù)擴增VSV-IN-G-NJ-G基因。將三個目的基因分別克隆至腺病毒穿梭載體pacAd-CMV K-NpA中,構(gòu)建含有目的基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒。利用PCR鑒定、雙酶切鑒定及測序鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒。將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒分別用Pac I酶線性化后,與同樣用Pac I酶線性化的骨架載體pacAd5 9.2-100共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞,成功包裝出了三株重組腺病毒rAd-VSV-NJ-G,r Ad-VSV-IN-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。將三種重組腺病毒分別接種于AAV-293細胞,連續(xù)傳代至20代,測定其TCID50,效價均穩(wěn)定。利用間接免疫熒光和western blot檢測方法檢測目的蛋白的表達,結(jié)果顯示G蛋白在重組腺病毒中均可以正確表達,且具有良好的反應(yīng)原性。為了評價三株重組腺病毒的免疫效果,本研究選取50只6~8周齡雌性BALB/c小鼠,隨機分為5組,每組10只。將三株重組腺病毒分別以2周為間隔,肌肉注射及皮下注射接種小鼠3次。于首次接種后0,2,4,6周采集血液分離血清,利用間接ELISA檢測VSV特異性抗體水平,結(jié)果顯示均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生VSV特異性抗體。以病毒中和試驗檢測中和抗體水平,其中和抗體水平均在1:16~1:32之間。利用淋巴細胞增殖試驗檢測細胞免疫水平,結(jié)果表明均可以引起接種小鼠強烈的淋巴細胞增殖效應(yīng),且明顯高于陰性對照組。以上結(jié)果表明,所構(gòu)建的三株重組腺病毒可以很好地表達目的蛋白,接種小鼠可以引起一定的體液免疫和細胞免疫反應(yīng),為表達VSV糖蛋白重組腺病毒疫苗的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：水泡性口炎病毒 G蛋白 重組腺病毒 免疫原性分析
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 英文縮略表11-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 流行概況及危害13-14
• 1.2 病原及其理化性質(zhì)14-15
• 1.3 病毒基因組結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)蛋白15-17
• 1.4 VSV疫苗研究進展17-18
• 1.4.1 滅活苗17
• 1.4.2 弱毒苗17-18
• 1.4.3 亞單位疫苗18
• 1.4.4 基因工程疫苗18
• 1.5 重組腺病毒疫苗研究進展18-20
• 1.5.1 腺病毒18-19
• 1.5.2 復(fù)制缺陷型腺病毒載體19
• 1.5.3 腺病毒載體在疫苗研究中的應(yīng)用19-20
• 1.6 本研究的目的和意義20-21
• 第二章 表達水泡性.炎病毒G蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定21-45
• 2.1 材料和方法21-26
• 2.1.1 菌株、細胞及質(zhì)粒21
• 2.1.2 主要試劑21-23
• 2.1.3 主要的儀器設(shè)備23
• 2.1.4 實驗所用主要試劑及配制方法23-26
• 2.2 實驗方法26-37
• 2.2.1 引物設(shè)計26
• 2.2.2 Vero細胞的培養(yǎng)26-27
• 2.2.3 VSV-NJ的增殖27
• 2.2.4 VSV-NJ病毒RNA的提取27-28
• 2.2.5 VSV-NJ-G基因的RT-PCR擴增28
• 2.2.6 VSV-IN-G基因的擴增28-29
• 2.2.7 VSV-IN-G-NJ-G基因的擴增29-30
• 2.2.8 E.coli DH5α 感受態(tài)細胞的制備30
• 2.2.9 將目的基因克隆至T載體30-31
• 2.2.10重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 2.2.11大量提取重組穿梭質(zhì)粒及骨架載體質(zhì)粒32-33
• 2.2.12重組腺病毒的構(gòu)建33-34
• 2.2.13重組腺病毒的鑒定34-36
• 2.2.14重組腺病毒的擴增及遺傳穩(wěn)定性分析36
• 2.2.15重組腺病毒G蛋白表達的鑒定36-37
• 2.3 實驗結(jié)果與分析37-43
• 2.3.1 VSV-NJ-G基因的擴增37-38
• 2.3.2 VSV-IN-G基因的擴增38
• 2.3.3 VSV-IN-G-NJ-G基因的擴增38-39
• 2.3.4 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建39
• 2.3.5 重組腺病毒的構(gòu)建39-41
• 2.3.6 重組腺病毒的擴增與遺傳穩(wěn)定性分析41
• 2.3.7 Western blot檢測G蛋白的表達41-42
• 2.3.8 間接免疫熒光檢測42-43
• 2.4 討論43-45
• 第三章 表達VSV G蛋白重組腺病毒對小鼠的免疫原性分析45-54
• 3.1 實驗材料45
• 3.1.1 細胞及病毒45
• 3.1.2 試劑及實驗動物45
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備45
• 3.2 實驗方法45-49
• 3.2.1 實驗動物的選擇和分組45-46
• 3.2.2 免疫原的制備46
• 3.2.3 動物免疫程序46
• 3.2.4 免疫后樣品采集46-47
• 3.2.5 抗VSV特異性抗體的檢測47
• 3.2.6 免疫小鼠中和抗體的檢測47-48
• 3.2.7 免疫小鼠T淋巴細胞增殖試驗48-49
• 3.3 結(jié)果49-52
• 3.3.1 抗VSV特異性抗體的檢測49
• 3.3.2 免疫小鼠中和抗體的檢測49-51
• 3.3.3 免疫小鼠淋巴細胞增殖試驗51-52
• 3.4 討論52-54
• 第四章 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻55-62
• 致謝62-63
• 作者簡歷63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 管潔;鄧瑤;陳紅;楊揚;文波;譚文杰;;表達丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3與core融合抗原的重組腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性與保護效果分析[J];病毒學(xué)報;2015年01期

2 王先煒;李玉峰;姜平;;表達豬圓環(huán)病毒2型Cap和豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5融合蛋白重組腺病毒的構(gòu)建和免疫原性測定[J];生物工程學(xué)報;2009年11期

3 楊玉艾;初曉輝;畢保良;楊亮宇;吳翱;邱春富;孫永科;;豬瘟病毒E0和E2蛋白融合表達的重組腺病毒構(gòu)建及免疫保護性研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2010年06期

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5 李曉芳;張敏敏;葛金英;溫志遠;王喜軍;陳偉業(yè);步志高;;表達水皰性口炎病毒G基因重組新城疫病毒的構(gòu)建及免疫原性研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2014年04期

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本文編號：712693