本文關(guān)鍵詞：表達(dá)水泡性口炎病毒G蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與免疫原性分析

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【摘要】：水泡性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV))引起的高度接觸性人畜共患的重大傳染性疫病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定通報(bào)傳染病,也是《中華人民共和國進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法》規(guī)定的進(jìn)境動(dòng)物二類傳染病。目前,該病還沒有有效的治療方法,只能通過疫苗進(jìn)行防控。在疫苗研究方面,國內(nèi)外已有一些研究,但新型疫苗的研究有待進(jìn)一步開發(fā)。VSV糖蛋白(G)定位在包膜的突起上,刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,呈現(xiàn)型乃至株的特異性,是研究VSV基因工程疫苗的首選抗原。本研究利用人5型復(fù)制缺陷型腺病毒為表達(dá)載體,構(gòu)建了表達(dá)VSV單一血清型的G蛋白及兩血清型G蛋白融合蛋白的重組腺病毒,并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步分析。本研究設(shè)計(jì)了三對(duì)分別擴(kuò)增VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因的特異性引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增VSV-IN-G基因及VSV-NJ-G基因;通過GlyGlyGlyGlySer多肽序列的連接,利用融合PCR技術(shù)擴(kuò)增VSV-IN-G-NJ-G基因。將三個(gè)目的基因分別克隆至腺病毒穿梭載體pacAd-CMV K-NpA中,構(gòu)建含有目的基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒。利用PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒。將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒分別用Pac I酶線性化后,與同樣用Pac I酶線性化的骨架載體pacAd5 9.2-100共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞,成功包裝出了三株重組腺病毒rAd-VSV-NJ-G,r Ad-VSV-IN-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。將三種重組腺病毒分別接種于AAV-293細(xì)胞,連續(xù)傳代至20代,測(cè)定其TCID50,效價(jià)均穩(wěn)定。利用間接免疫熒光和western blot檢測(cè)方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示G蛋白在重組腺病毒中均可以正確表達(dá),且具有良好的反應(yīng)原性。為了評(píng)價(jià)三株重組腺病毒的免疫效果,本研究選取50只6~8周齡雌性BALB/c小鼠,隨機(jī)分為5組,每組10只。將三株重組腺病毒分別以2周為間隔,肌肉注射及皮下注射接種小鼠3次。于首次接種后0,2,4,6周采集血液分離血清,利用間接ELISA檢測(cè)VSV特異性抗體水平,結(jié)果顯示均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生VSV特異性抗體。以病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)中和抗體水平,其中和抗體水平均在1:16~1:32之間。利用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞免疫水平,結(jié)果表明均可以引起接種小鼠強(qiáng)烈的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng),且明顯高于陰性對(duì)照組。以上結(jié)果表明,所構(gòu)建的三株重組腺病毒可以很好地表達(dá)目的蛋白,接種小鼠可以引起一定的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),為表達(dá)VSV糖蛋白重組腺病毒疫苗的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：水泡性口炎病毒 G蛋白 重組腺病毒 免疫原性分析
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 英文縮略表11-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 流行概況及危害13-14
• 1.2 病原及其理化性質(zhì)14-15
• 1.3 病毒基因組結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)蛋白15-17
• 1.4 VSV疫苗研究進(jìn)展17-18
• 1.4.1 滅活苗17
• 1.4.2 弱毒苗17-18
• 1.4.3 亞單位疫苗18
• 1.4.4 基因工程疫苗18
• 1.5 重組腺病毒疫苗研究進(jìn)展18-20
• 1.5.1 腺病毒18-19
• 1.5.2 復(fù)制缺陷型腺病毒載體19
• 1.5.3 腺病毒載體在疫苗研究中的應(yīng)用19-20
• 1.6 本研究的目的和意義20-21
• 第二章 表達(dá)水泡性.炎病毒G蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定21-45
• 2.1 材料和方法21-26
• 2.1.1 菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒21
• 2.1.2 主要試劑21-23
• 2.1.3 主要的儀器設(shè)備23
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑及配制方法23-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-37
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)26
• 2.2.2 Vero細(xì)胞的培養(yǎng)26-27
• 2.2.3 VSV-NJ的增殖27
• 2.2.4 VSV-NJ病毒RNA的提取27-28
• 2.2.5 VSV-NJ-G基因的RT-PCR擴(kuò)增28
• 2.2.6 VSV-IN-G基因的擴(kuò)增28-29
• 2.2.7 VSV-IN-G-NJ-G基因的擴(kuò)增29-30
• 2.2.8 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備30
• 2.2.9 將目的基因克隆至T載體30-31
• 2.2.10重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 2.2.11大量提取重組穿梭質(zhì)粒及骨架載體質(zhì)粒32-33
• 2.2.12重組腺病毒的構(gòu)建33-34
• 2.2.13重組腺病毒的鑒定34-36
• 2.2.14重組腺病毒的擴(kuò)增及遺傳穩(wěn)定性分析36
• 2.2.15重組腺病毒G蛋白表達(dá)的鑒定36-37
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析37-43
• 2.3.1 VSV-NJ-G基因的擴(kuò)增37-38
• 2.3.2 VSV-IN-G基因的擴(kuò)增38
• 2.3.3 VSV-IN-G-NJ-G基因的擴(kuò)增38-39
• 2.3.4 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建39
• 2.3.5 重組腺病毒的構(gòu)建39-41
• 2.3.6 重組腺病毒的擴(kuò)增與遺傳穩(wěn)定性分析41
• 2.3.7 Western blot檢測(cè)G蛋白的表達(dá)41-42
• 2.3.8 間接免疫熒光檢測(cè)42-43
• 2.4 討論43-45
• 第三章 表達(dá)VSV G蛋白重組腺病毒對(duì)小鼠的免疫原性分析45-54
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 3.1.1 細(xì)胞及病毒45
• 3.1.2 試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法45-49
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組45-46
• 3.2.2 免疫原的制備46
• 3.2.3 動(dòng)物免疫程序46
• 3.2.4 免疫后樣品采集46-47
• 3.2.5 抗VSV特異性抗體的檢測(cè)47
• 3.2.6 免疫小鼠中和抗體的檢測(cè)47-48
• 3.2.7 免疫小鼠T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)48-49
• 3.3 結(jié)果49-52
• 3.3.1 抗VSV特異性抗體的檢測(cè)49
• 3.3.2 免疫小鼠中和抗體的檢測(cè)49-51
• 3.3.3 免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)51-52
• 3.4 討論52-54
• 第四章 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 致謝62-63
• 作者簡(jiǎn)歷63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 管潔;鄧瑤;陳紅;楊揚(yáng);文波;譚文杰;;表達(dá)丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3與core融合抗原的重組腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性與保護(hù)效果分析[J];病毒學(xué)報(bào);2015年01期

2 王先煒;李玉峰;姜平;;表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap和豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5融合蛋白重組腺病毒的構(gòu)建和免疫原性測(cè)定[J];生物工程學(xué)報(bào);2009年11期

3 楊玉艾;初曉輝;畢保良;楊亮宇;吳翱;邱春富;孫永科;;豬瘟病毒E0和E2蛋白融合表達(dá)的重組腺病毒構(gòu)建及免疫保護(hù)性研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年06期

4 韋顯凱;侯繼波;姜平;;表達(dá)豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2008年10期

5 李曉芳;張敏敏;葛金英;溫志遠(yuǎn);王喜軍;陳偉業(yè);步志高;;表達(dá)水皰性口炎病毒G基因重組新城疫病毒的構(gòu)建及免疫原性研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年04期

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本文編號(hào)：712693