發(fā)布時間：2017-08-10 06:04

  本文關(guān)鍵詞：水稻瘤矮病毒在介體電光葉蟬中經(jīng)卵傳播的研究

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【摘要】：近年來由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)所引起的水稻瘤矮病在我國廣東省稻區(qū)流行。RGDV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus),主要由介體電光葉蟬(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式傳播。目前,國內(nèi)外學者己對RGDV的發(fā)生、危害、病害癥狀、基因組結(jié)構(gòu)與功能等做了大量的研究。然而關(guān)于RGDV在介體電光葉蟬中是否能經(jīng)卵傳播的問題還存在爭議,有關(guān)RGDV在介體電光葉蟬卵巢內(nèi)的侵染過程還未有相關(guān)報道。本研究利用分子檢測技術(shù)即RT-PCR法,對RGDV是否能在其主要介體電光葉蟬中經(jīng)卵傳播進行了驗證。為避免因帶毒雌蟲取食而感染產(chǎn)卵稻苗,挑取毒蟲蟲卵移至濕潤濾紙上,孵化后立即轉(zhuǎn)移至新的試管健康苗上單管單蟲飼養(yǎng)至羽化。結(jié)果表明：帶毒蟲的Fl代和F2代平均帶毒率分別為78.6%和80.0%,初步證明RGDV能夠通過介體電光葉蟬經(jīng)卵傳播。為了進一步驗證病毒如何侵入卵,本研究用卵殼處理試劑——季銨鹽萃取劑(1%Hyamine)按照時間梯度處理蟲卵,檢測結(jié)果表明不同時間梯度處理組與水處理對照組的昆蟲平均帶毒率為75%左右。因此我們初步認為卵殼不參與RGDV的經(jīng)卵傳播,RGDV在排卵之前即攜帶病毒。此外,通過雌雄蟲水盤交配試驗發(fā)現(xiàn)帶毒雌蟲與無毒雄蟲交配的后代帶毒,而無毒雌蟲與帶毒雄蟲交配的后代不帶毒,表明后代的帶毒情況只與雌蟲是否帶毒相關(guān),而與雄蟲無關(guān)。且無毒蟲與帶毒蟲交配后不發(fā)生蟲體間的水平傳播,即RGDV在介體電光葉蟬中不能通過交配傳播。為了明確RGDV侵染卵巢的過程,本研究通過免疫熒光標記技術(shù)系統(tǒng)地分析了電光葉蟬飼毒并羽化后不同天數(shù)RGDV在介體電光葉蟬生殖系統(tǒng)的分布情況。結(jié)果表明：雌性電光葉蟬羽化后第1-2天,RGDV首先會侵染卵巢端絲、卵管柄及輸卵管部位；第3～4天RGDV出現(xiàn)在生殖區(qū)部位建立侵染點并大量增殖；第5-6天RGDV從生殖區(qū)侵染點擴散至整個生殖區(qū)；第7-8天、9-10天RGDV隨著卵巢的發(fā)育向卵柄方向擴散,在生長區(qū)和卵黃形成區(qū)先后有RGDV的分布,至此整個卵巢管有大量RGDV的分布。該研究結(jié)果系統(tǒng)地闡述了RGDV在電光葉蟬卵巢的侵染過程,使我們對病毒在介體昆蟲卵巢的侵染有了進一步的認識。RGDV屬于持久增殖型病毒,其存在于介體電光葉蟬體內(nèi)的各個組織中并且能夠進行大量的復制增殖。已有研究結(jié)果認為RGDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白Pnsll是形成病毒管狀結(jié)構(gòu)的組分,RGDV借助管狀結(jié)構(gòu)進行擴散。為此,本研究通過標記RGDV Pns11在電光葉蟬卵巢中的分布,以期進一步觀察RGDV在卵巢中的擴散過程。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),RGDV在卵巢生殖區(qū)的濾泡細胞大量增殖后利用Pns11管狀結(jié)構(gòu)擴散到內(nèi)部的卵母細胞；同時,RGDV在生殖區(qū)增殖后直接沿著不斷發(fā)育延伸的濾泡細胞向卵柄方向擴散；到達卵黃原形成區(qū)時,RGDV利用Pns11管狀結(jié)構(gòu)沿著濾泡細胞與卵黃膜之間的營養(yǎng)運輸通道——微絨毛結(jié)構(gòu)擴散到卵內(nèi),最終侵染后代。而通過透射電子顯微鏡觀察卵巢切片,也證明了上述結(jié)論。綜上所述,本論文通過分子檢測技術(shù)明確了RGDV能夠通過介體電光葉蟬經(jīng)卵傳播,并通過免疫熒光標記技術(shù)和透射電鏡技術(shù)直觀地闡明了RGDV在電光葉蟬卵巢內(nèi)的侵染過程,初步鑒定了RGDV編碼的管狀結(jié)構(gòu)蛋白Pns11參與RGDV在電光葉蟬卵巢內(nèi)的擴散,促進了對水稻病毒在介體昆蟲卵巢內(nèi)的侵染機理的進一步認識,為進一步闡明病毒在介體昆蟲經(jīng)卵傳播的機制提供了依據(jù),也為開拓新的病害防治途徑奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：水稻瘤矮病毒 電光葉蟬 經(jīng)卵傳播 免疫熒光 透射電子顯微鏡
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.41
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-23
• 1.1 水稻瘤矮病毒的研究現(xiàn)狀11-15
• 1.1.1 水稻瘤矮病的發(fā)生和流行11
• 1.1.2 RGDV的病害特征11-12
• 1.1.3 RGDV的寄主與傳播介體12-14
• 1.1.4 RGDV的病原性質(zhì)和基因組結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2 介體昆蟲傳播植物病毒機制的研究進展15-19
• 1.2.1 非持久傳播型以及半持久傳播型植物病毒的傳毒機理16
• 1.2.2 持久傳播型植物病毒的蟲傳機理16-19
• 1.2.2.1. 持久非增殖病毒介體傳毒機理研究18
• 1.2.2.2. 持久增殖型病毒介體傳毒機理研究18-19
• 1.3 免疫熒光技術(shù)19-20
• 1.4 病毒經(jīng)卵傳播的研究進展20-21
• 1.5 本研究的目的和意義21-23
• 2 材料與方法23-31
• 2.1 材料、試劑與實驗儀器23-24
• 2.1.1 材料來源23
• 2.1.2 主要試劑23
• 2.1.3 主要儀器及設(shè)備23-24
• 2.2 實驗方法24-31
• 2.2.1 飼毒24
• 2.2.2 RT-PCR技術(shù)檢測RGDV24-26
• 2.2.2.1 引物設(shè)計24
• 2.2.2.2 提取RGDV侵染的電光葉蟬總RNA24-25
• 2.2.2.3 RGDV P8的cDNA的合成25
• 2.2.2.4 PCR擴增RGDV P8基因25-26
• 2.2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測26
• 2.2.3 RGDV在介體電光葉蟬中垂直傳播的驗證26-28
• 2.2.3.1 RGDV在介體電光葉蟬后代帶毒率的檢測26-27
• 2.2.3.2 卵殼攜帶病毒經(jīng)卵傳播的驗證27
• 2.2.3.3 交配傳毒對后代昆蟲帶毒率的影響27-28
• 2.2.4 電光葉蟬的解剖28-29
• 2.2.5 免疫熒光標記29
• 2.2.6 透射電子顯微鏡常規(guī)(溫)包埋、切片、染色及觀察29-31
• 3 實驗結(jié)果與分析31-47
• 3.1 電光葉蟬的帶毒率檢測31-32
• 3.2 RGDV在介體電光葉蟬中垂直傳播的驗證32-33
• 3.2.1 電光葉蟬后代帶毒率的檢測32
• 3.2.2 卵殼攜帶病毒經(jīng)卵傳播的驗證32-33
• 3.2.3 交配傳毒及對后代昆蟲帶毒率的影響33
• 3.3 利用免疫熒光技術(shù)研究RGDV在電光葉蟬卵巢的侵染過程33-44
• 3.3.1 電光葉蟬雌性生殖系統(tǒng)的形態(tài)學觀察33-35
• 3.3.2 RGDV在電光葉蟬卵巢的侵染過程35-39
• 3.3.3 RGDV編碼的管狀結(jié)構(gòu)蛋白Pns11在卵巢中的標記39-42
• 3.3.4 RGDV與Pns11管狀結(jié)構(gòu)的共定位觀察42-44
• 3.4 透射電子顯微鏡觀察RGDV在電光葉蟬卵巢的侵染過程44-46
• 3.5 小結(jié)46-47
• 4 討論47-51
• 4.1 關(guān)于卵殼攜帶病毒經(jīng)卵傳播的討論47
• 4.2 關(guān)于經(jīng)交配傳毒和精子傳毒的可能性分析47-48
• 4.3 關(guān)于入卵機制的討論48-49
• 4.4 本研究的特色和創(chuàng)新之處49
• 4.5 值得繼續(xù)研究方向49-51
• 參考文獻51-59
• 附錄59-60
• 致謝60

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號：649144