本文關鍵詞：檢測3型鴨甲肝病毒免疫組化方法建立和應用

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【摘要】：3型鴨甲肝病毒(DHAV-3)是嚴重危害雛鴨的病原,雛鴨感染可造成嚴重發(fā)病和死亡。本研究試圖建立檢測DHAV-3的免疫組化方法,對該病毒在感染雛鴨體內的分布進行定位檢測,探索DHAV-3在感染雛鴨體內分布規(guī)律,為闡明DHAV-3的致病機理提供參考數(shù)據(jù),為本病的診斷和甲醛保存樣品的回顧性診斷提供可靠的實驗室診斷方法。1.檢測DHAV-3免疫組化方法的建立DHAV-3接種10日齡鴨胚,收集36h-72h死亡高峰期的且胚體病變情況明顯的鴨胚尿囊液,用差速離心-氯仿抽提-超速離心獲得初步純化DHAV-3抗原,免疫家兔后獲得兔抗DHAV-3高免血清,提取兔抗DHAV-3 IgG,建立和優(yōu)化了檢測DHAV-3免疫組化方法。該法能夠特異性檢測DHAV-3感染雛鴨組織(心臟、肝臟、脾臟等)的病毒抗原,而鴨瘟、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌感染發(fā)病死亡雛鴨和健康雛鴨呈現(xiàn)陰性反應,具有良好的特異性。2.雛鴨不同途徑人工感染DHAV-3病理模型的構建和免疫組化檢測對300只無母源抗體1日齡雛鴨隨機分成4組,1-3攻毒組90只／組,對照組30只,飼養(yǎng)至3日齡進行人工感染,攻毒組感染途徑分別為口服、滴鼻、肌肉注射,劑量為0.4ml/只的DHAV-3感染死亡3日齡雛鴨肝臟勻漿,4組注射生理鹽水為對照。攻毒組在人工感染后的1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、 192h、240h、14d時間點隨機剖殺6只,對照組剖殺2只,采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、胰腺、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、法氏囊、哈氏腺、胸腺、肌肉16個組織器官的樣品,使用4%的多聚甲醛固定,記錄各組雛鴨的發(fā)病死亡數(shù)量和死亡時間段,應用建立的免疫組化方法進行檢測。人工感染后的24h～26h肌注組最先出現(xiàn)死亡,口服組和滴鼻組的雛鴨最初出現(xiàn)死亡時間相近,即人工感染后的36h-38h內。各組死亡高峰期均處于36h-72h,隨著時間的推移,口服組、滴鼻組和肌注組雛鴨的死亡數(shù)量都在48h左右到達最高峰,隨后呈現(xiàn)遞減趨勢,肌注組在96h內雛鴨死亡數(shù)量呈正態(tài)分布趨勢�？诜M、滴鼻組和肌注組的試驗分別于攻毒后的144h、192h和120h結束,滴鼻組的死亡情況最為嚴重,其次是口服組,肌注組死亡最少,對照組未出現(xiàn)死亡情況。收集的感染DHAV-3死亡雛鴨心臟、肝臟、脾臟等16個組織器官均能檢測出強烈的陽性信號,不同途徑感染鴨體內的病毒分布情況則表明DHAV-3侵害雛鴨的主要靶器官為肝臟、脾臟、腎臟和腸道。隨著感染時間的推移,靶器官陽性信號強度呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢,至72h左右達到最強。法氏囊、哈氏腺、胸腺為代表的免疫器官陽性信號的強度呈現(xiàn)強弱交替的情況,其余的非靶器官呈現(xiàn)中等或弱陽性。3.不同時間點DHAV-3病毒抗原在雛鴨組織內的定位和分布情況人工感染后1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、192h三組雛鴨體內組織器官病毒分布情況如下：(1)口服組：十二指腸、空腸、回腸、直腸、法氏囊、哈氏腺、胸腺7個組織器官在攻毒后1h就檢測出陽性信號,心臟、肝臟、脾臟、腎臟、盲腸5個組織器官在攻毒后4h檢測出陽性信號,胰腺、肺臟在攻毒后6h有陽性信號呈現(xiàn),肌肉在攻毒后24h檢測出陽性信號,大腦在攻毒后36h組化結果呈現(xiàn)陽性。(2)肌注組：攻毒后1h十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、法氏囊、哈氏腺、胸腺、肌肉10個組織器官中就能檢測出3型鴨甲肝病毒,攻毒后2h肝臟、腎臟中也分布有病毒抗原,心臟、脾臟、肺臟在攻毒后4h檢測出病毒抗原,胰腺在攻毒后12h檢測出病毒抗原,大腦在攻毒后36h檢測出病毒抗原。(3)滴鼻組：心臟、法氏囊在攻毒后2h組化結果呈現(xiàn)陽性,肌肉在攻毒后4h組化結果呈現(xiàn)陽性,其余組織均在攻毒后的1h就檢測出陽性信號。綜上：本研究建立的免疫組化檢測DHAV-3的方法具有良好的特異性,可用于DHAV-3感染雛鴨組織的亞細胞定位、DHAV-3感染死亡雛鴨的診斷、甲醛保存樣品的回顧性診斷。DHAV-3經(jīng)口服、滴鼻、肌肉注射途徑感染雛鴨均可導致發(fā)病后死亡,死亡高峰期均處于36h～72h,雛鴨經(jīng)滴鼻感染死亡最為嚴重。DHAV-3在感染雛鴨體內的分布規(guī)律為闡明DHAV-3的致病機理提供了有用的科學數(shù)據(jù)。
【關鍵詞】：3型鴨甲肝病毒 免疫組化方法 抗原定位 病毒分布
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.32
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮略詞表8-11
• 一 引言11-16
• 1 鴨甲型肝炎病毒概述11-13
• 1.1 歷史與分布11
• 1.2 分型11
• 1.3 致病力11-12
• 1.3.1 流行病學11-12
• 1.3.2 臨床癥狀和病理變化12
• 1.4 DHAV-3簡述12-13
• 2 鴨甲型肝炎病毒的檢測方法和定位及分布研究進展13-14
• 2.1 鴨甲型肝炎病毒檢測方法的研究進展13
• 2.2 鴨甲型肝炎病毒在體內定位和分布研究進展13-14
• 3 免疫組化技術概述14-15
• 4 本研究目的和意義15-16
• 二 試驗研究16-49
• 1 試驗材料16-19
• 1.1 試驗毒株16
• 1.2 參考毒(菌)株16
• 1.3 試驗動物16
• 1.4 試劑16-17
• 1.5 試驗儀器17-18
• 1.6 其他18-19
• 2 方法19-23
• 2.1 兔抗DHAV-3高免血清的制備及其IgG提取和鑒定19-20
• 2.1.1 DHAV-3抗原制備19
• 2.1.2 兔抗DHAV-3血清的制備19
• 2.1.3 兔抗DHAV-3血清中IgG的提取19-20
• 2.1.4 IgG的鑒定20
• 2.2 檢測雛鴨感染DHAV-3免疫組化方法的建立和優(yōu)化20-22
• 2.2.1 間接免疫酶組織化學法的基本試驗步驟20-21
• 2.2.2 優(yōu)化方案篩選21
• 2.2.3 讀片標準21-22
• 2.2.4 特異性試驗22
• 2.3 DHAV-3不同途徑人工感染雛鴨病理模型的構建22-23
• 2.4 DHAV-3感染雛鴨體內病毒定位和分布檢測23
• 3 結果和分析23-44
• 3.1 兔抗DHAV-3抗體的制備和純化23-25
• 3.1.1 DHAV-3的增殖和純化23-24
• 3.1.2 兔抗DHAV-3抗體的制備與純化24-25
• 3.2 檢測雛鴨感染DHAV-3免疫組化方法的建立和優(yōu)化25-34
• 3.2.1 間接免疫酶組化方法染色步驟25-26
• 3.2.2 特異性試驗26-34
• 3.3 DHAV-3不同途徑人工感染雛鴨病理模型的構建34-35
• 3.3.1 不同途徑人工感染雛鴨的死亡情況35
• 3.4 免疫組化檢測不同途徑雛鴨感染DHAV-3體內抗原定位和分布35-44
• 3.4.1 免疫組化檢測感染雛鴨組織染色結果35-41
• 3.4.2 不同途徑感染雛鴨各組織免疫組化檢測結果41-44
• 4 討論44-49
• 4.1 病毒純化及抗體制備44
• 4.2 檢測雛鴨感染DHAV-3免疫組化方法的建立44-46
• 4.2.1 免疫組化方法的建立和優(yōu)化44-45
• 4.2.2 免疫組化方法的優(yōu)勢45-46
• 4.2.3 免疫組化與檢測DHAV其他方法的比較46
• 4.3 感染DHAV-3病毒分布規(guī)律和病毒致病性的關系46-48
• 4.3.1 不同途徑DHAV-3在雛鴨體內分布規(guī)律的比較及其意義46-47
• 4.3.2 DHAV-3在組織器官的分布特點與病毒特性的關系47-48
• 4.4 雛鴨感染DHAV-3病毒分布和感染DHAV-1病毒分布的比較48-49
• 三 結論49-50
• 參考文獻50-55
• 致謝55-56
• 附錄56-58

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳紅梅;施少華;程龍飛;傅光華;萬春和;黃瑜;;鵝源鴨1型甲肝病毒的分離與鑒定[J];福建農業(yè)學報;2012年11期

2 張大丙;;鴨甲肝病毒的分子生物學研究進展[J];中國獸醫(yī)雜志;2010年03期

3 張煥容;皮晉魁;黃志宏;;基因C型鴨甲肝病毒實驗感染雛鴨的組織病理學及病毒分布[J];畜牧獸醫(yī)學報;2013年04期

4 陳珍;傅秋玲;陳紅梅;傅光華;施少華;程龍飛;萬春和;林建生;黃瑜;;胰腺型、經(jīng)典型鴨1型甲肝病毒對雛鴨的致病性差異[J];福建農業(yè)學報;2013年10期

5 施少華;陳紅梅;陳珍;傅光華;萬春和;程龍飛;蘇敬良;黃瑜;;鴿源鴨甲肝病毒1型的分離與鑒定[J];福建農業(yè)學報;2012年11期

6 黃秋雪;湯承;聶培婷;岳華;;鴨甲肝病毒基因A型和C型雙重RT-PCR檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2012年02期

7 皮晉魁;聶培婷;黃秋雪;岳華;張煥容;;基因C型鴨甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表達[J];中國預防獸醫(yī)學報;2012年09期

8 喬煜婷;曹華斌;胡國良;陳全姣;;免疫磁珠富集與SYB RGreen熒光定量PCR技術聯(lián)合檢測水體中甲肝病毒[J];內蒙古農業(yè)大學學報(自然科學版);2014年02期

9 彭小薇;徐永亮;王笑言;付余;張大丙;;鴨甲肝病毒VP1基因的克隆和序列分析[J];中國獸醫(yī)雜志;2009年09期

10 傅秋玲;傅光華;陳紅梅;施少華;陳珍;程龍飛;萬春和;林建生;黃瑜;;胰腺炎型鴨1型甲肝病毒結構蛋白VP1基因的克隆和表達[J];福建農業(yè)學報;2014年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳紅梅;施少華;程龍飛;傅光華;萬春和;黃瑜;;鵝源鴨1型甲肝病毒的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術研討會論文集[C];2013年

2 張明露;楊健;趙宏;朱琳;趙化冰;蔡寶立;;渤海灣天津沿岸海水中甲肝病毒的檢測和定量[A];2008年中國微生物學會學術年會論文摘要集[C];2008年

3 潘夢;楊小蓉;郭鑫;張大丙;楊漢春;;鴨甲肝病毒基因組變異性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十五次學術研討會論文集[C];2010年

4 王笑言;張大丙;;鴨甲肝病毒熒光定量RT-PCR的建立和初步應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

5 謝小雨;袁媛;張大丙;;一株鴨甲肝病毒3型雞胚化弱毒株的培育[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

6 周國梅;張瑞華;辛英豪;陳君豪;陳琳琳;徐倩;謝之景;朱巖麗;姜世金;;鴨甲肝病毒1型一個保守的中和性線性B細胞表位的確定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

7 謝小雨;袁媛;張大丙;;鴨甲肝病毒3型強弱毒株的基因組序列比較[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

8 王瑋;褚東琳;李景良;王擁軍;趙小琳;;甲肝病毒MBB株的克隆優(yōu)化[A];2011中國生物制品年會暨第十一次全國生物制品學術研討會論文集[C];2011年

9 黃懿;梁淑芳;劉寶紅;于延豹;陸豪杰;陳先;楊們原;;芯片酶解微反應器用于甲肝病毒蛋白質組的快速酶解鑒定[A];中國蛋白質組學第三屆學術大會論文摘要[C];2005年

10 王隴德;;中國人需要一場行為和膳食革命[A];全國公共衛(wèi)生與食物營養(yǎng)高層論壇暨中國營養(yǎng)學會與保健食品分會第四屆學術研討會論文集[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 任勇;酷夏別為嘴傷“肝兒”[N];天津日報;2004年

2 曉艷;制造甲肝病毒的基因被發(fā)現(xiàn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

3 西安交大醫(yī)學院一附院 傳染科 副教授 樊萬虎;春夏季怎樣預防甲肝[N];家庭醫(yī)生報;2005年

4 李瑩;春季如何預防甲肝[N];農村醫(yī)藥報（漢）;2008年

5 本報記者 孫燕明;食品也能傳染甲肝[N];中國消費者報;2003年

6 主任醫(yī)師 于長水;甲肝的傳播及預防[N];云南科技報;2002年

7 董文蘭;春天小心吃出病來[N];山西日報;2001年

8 胥廷輝;筑起預防甲肝的“防火墻”[N];甘肅日報;2004年

9 李善美;春天防病生活總動員[N];中國醫(yī)藥報;2004年

10 毛頌贊;數(shù)字解讀甲型肝炎[N];家庭醫(yī)生報;2008年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 蔣燕軍;感染性甲肝病毒的特異性檢測和嵌合甲肝病毒的構建[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 張玉瑤;鴨甲肝病毒1型和3型抗體間接ELISA檢測方法的建立與應用[D];山東農業(yè)大學;2015年

2 林少莉;1型和3型鴨甲肝病毒在臨床死亡雛鴨體內分布的研究[D];山東農業(yè)大學;2015年

3 文興建;鴨甲肝病毒1和3型一步法雙重RT-PCR檢測方法的建立及應用[D];四川農業(yè)大學;2015年

4 柯晨;檢測3型鴨甲肝病毒免疫組化方法建立和應用[D];四川農業(yè)大學;2015年

5 喬煜婷;水體中甲肝病毒富集和檢測方法的研究[D];江西農業(yè)大學;2014年

6 李井新;鴨甲肝病毒1型和3型實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及其在雛鴨體內動態(tài)分布規(guī)律的研究[D];山東農業(yè)大學;2013年

7 胡大海;甲肝病毒3C蛋白酶識別序列有效性的研究[D];吉林大學;2015年

8 黃秋雪;基因C型鴨甲肝病毒PCR檢測方法的建立及動態(tài)定量分布[D];西南民族大學;2012年

，

本文編號：649032