本文關(guān)鍵詞：水稻熱激蛋白基因OsDjA6介導的抗稻瘟病功能分析

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【摘要】：水稻是我國重要糧食作物。稻瘟病為影響水稻生產(chǎn)三大病害之一,由子囊菌Magnaporthe oryzae引起,每年可造成水稻減產(chǎn)約15%-20%,嚴重時可達40%-50%,甚至顆粒兀收。因此防控稻瘟病是水稻生產(chǎn)、保障糧食安全的客觀需求。熱激蛋白為一類大基因家族編碼,根據(jù)其蛋白分子量分為五類：sHSP、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100。HSP40是一類分子量為40 kDa的sHSP (small HSP, sHSP),已被報道參與植物如煙草、水稻抗病毒反應(yīng)途徑,但針對其與真菌性病害關(guān)聯(lián)研究鮮有報道。本研究挑選水稻接種稻瘟菌之后,經(jīng)深度轉(zhuǎn)錄組學分析的一個表達上調(diào)DnaJ (HSP40)基因,構(gòu)建其RNAi載體并獲得了相應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系。從轉(zhuǎn)基因株系中篩選陽性株系,選用轉(zhuǎn)基因純合株系進行稻瘟菌接種及表型鑒定,探討其抗性機理,具體結(jié)果如下：1、在深度轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)庫MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing)中,DnaJ在水稻接種非親和稻瘟菌小種后12h受誘導表達,而在親和及空白對照無明顯變化,表明DnaJ可能參與水稻抗稻瘟病反應(yīng)；2、基因序列分析和比對研究表明DnaJ編碼一個含有J-domain結(jié)構(gòu)域蛋白,屬DnaJ家族type A類別,該基因命名為OsDjA6;3、利用農(nóng)桿菌介導法,將RNAi載體轉(zhuǎn)化水稻品種泰粳394,獲得轉(zhuǎn)基因株系,采用潮霉素抗性基因和nCherry紅色熒光檢測相結(jié)合方法鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株,獲得的陽性植株用于后續(xù)抗病檢測。qRT-PCR鑒定證實OsDjA6表達量在其RNAi轉(zhuǎn)基因陽性株系中明顯下調(diào)；4、選取轉(zhuǎn)基因純合株系T2代幼苗,用稻瘟菌小種“RO1-1”孢子懸浮液進行室內(nèi)噴霧接種,經(jīng)過三次重復,最終確定了3個獨立株系來進行"punch"接種實驗,結(jié)果證實OsDjA6的RNAi株系對稻瘟菌小種“RO1-1”抗性明顯增強；5、檢測了經(jīng)PAMP誘導子flg22和chitin處理OsDjA6的RNAi轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株后活性氧積累,結(jié)果顯示flg22處理后,轉(zhuǎn)基因株系活性氧積累量相對野生型有所提高,而chitin處理之后卻沒有明顯變化,該研究結(jié)果表明OsDjA6參與水稻抵抗病原菌PTI的免疫過程調(diào)控；6、熒光定量PCR檢測顯示在OsDjA6 RNAi轉(zhuǎn)基因株系中,三個防御反應(yīng)相關(guān)基因PR5、NH1和WRKY45表達量上調(diào),表明OsDjA6可能通過調(diào)控SA信號途徑來介導水稻對稻瘟菌的抗性反應(yīng)。7、水稻原生質(zhì)體瞬時表達OsDjA6與熒光融合蛋白證實OsDjA6于細胞膜和細胞核,且OsDjA6勺J-domain, ZF-domain等不同結(jié)構(gòu)域不影響其細胞定位；8、為了進一步闡明OsDjA6調(diào)節(jié)抗稻瘟病的信號通路,本研究以BD-OsDjA6為誘餌蛋白篩選水稻cDNA文庫,發(fā)現(xiàn)一個C3HC4類型E3泛素連接酶蛋白與OsDjA6在酵母中互作；酵母雙雜交表明OsDjA6可在酵母中抑制水稻抗稻瘟病關(guān)鍵調(diào)控因子OsSGT1生長。上述結(jié)果為深入研究OsDjA6與稻瘟菌分子互作機理奠定了基礎(chǔ)；以沉默水稻熱激蛋白基因來抵御真菌侵染,為稻瘟病防控、水稻抗性新品種培育提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：植物免疫 稻瘟菌 熱激蛋白 酵母雙雜交
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.41
【目錄】：

• 摘要4-6
• abstract6-10
• 第1章 緒論10-21
• 1.1 水稻與稻瘟菌10-12
• 1.1.1 稻瘟病危害10
• 1.1.2 稻瘟菌侵染機制10-12
• 1.1.3 稻瘟病防治12
• 1.2 植物免疫12-15
• 1.2.1 植物PTI免疫反應(yīng)13-14
• 1.2.2 植物ETI免疫防御系統(tǒng)14-15
• 1.3 熱激蛋白研究進展15-19
• 1.3.1 熱激蛋白分類15-18
• 1.3.2 DnaJ蛋白研究概況18-19
• 1.4 本研究目的與意義19-20
• 1.5 技術(shù)路線20-21
• 第2章 OsDjA6 RNAi載體的構(gòu)建21-33
• 2.1 實驗材料21-23
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 載體菌株21
• 2.1.3 抗生素和限制性內(nèi)切酶21
• 2.1.4 其它酶,試劑盒,引物合成及測序21
• 2.1.5 其它化學試劑及耗材,儀器21-22
• 2.1.6 培養(yǎng)基22
• 2.1.7 引物設(shè)計及序列比對22-23
• 2.1.8 引物信息23
• 2.2 實驗方法23-30
• 2.2.1 水稻品種TG394 cDNA序列獲得23-25
• 2.2.2 入門載體的構(gòu)建25-30
• 2.3 結(jié)果與分析30-32
• 2.3.1 水稻cDNA的獲得30
• 2.3.2 目的基因相關(guān)信息的獲取30
• 2.3.3 載體構(gòu)建30-32
• 2.4 討論32-33
• 第3章 OsDjA6介導的水稻抗病表型鑒定33-44
• 3.1 材料與方法33-37
• 3.1.1 材料33-34
• 3.1.2 方法34-37
• 3.2 結(jié)果37-43
• 3.2.1 轉(zhuǎn)基因株系的獲取37-38
• 3.2.2 OsDjA6 RNAi轉(zhuǎn)基因陽性基因型鑒定38-39
• 3.2.3 OsDjA6 RNAi轉(zhuǎn)基因純合株系接種表型鑒定39-40
• 3.2.4 OsDjA6突變體和超表達株系的鑒定40-43
• 3.3 討論43-44
• 第4章 OsDjA6介導的抗病機理研究44-54
• 4.1 材料與方法44-49
• 4.1.1 材料44-46
• 4.1.2 方法46-49
• 4.2 結(jié)果49-52
• 4.2.1 OsDjA6參與調(diào)控SA信號反應(yīng)途徑49
• 4.2.2 OsDjA6全細胞定位49-50
• 4.2.3 OsDjA6在酵母中抑制OsSGT1生長50-51
• 4.2.4 OsDjA6與C3HC4 E3在酵母體內(nèi)發(fā)生互作51-52
• 4.3 討論52-54
• 第5章 全文結(jié)論54-56
• 參考文獻56-66
• 致謝66-68
• 作者簡歷68

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊玖霞;水稻熱激蛋白基因OsDjA6介導的抗稻瘟病功能分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2015年

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本文編號：561671