本文關(guān)鍵詞：蓮藕酵母雙雜交cDNA文庫(kù)及PPO基因誘餌載體構(gòu)建

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【摘要】：蓮藕(Nelumbo nucifera),屬蓮科多年生水生草本植物,具有降脂降壓、減緩氧化、防治脂肪肝等藥理作用,是一種藥食同源的食品。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)蓮藕需求日益增多,但蓮藕在貯藏保鮮和加工過(guò)程中存在褐變問(wèn)題,導(dǎo)致其商品性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的下降,嚴(yán)重影響了蓮藕的出口創(chuàng)匯及醫(yī)療效果。研究發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶(PPO)參與色素的形成過(guò)程,是導(dǎo)致蓮藕褐變的關(guān)鍵酶之一,也在蓮藕抵抗病蟲(chóng)害等過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。但是目前對(duì)PPO的研究主要集中在理化特性方面,有關(guān)其基因功能和機(jī)理機(jī)制的研究還很少。因此,本實(shí)驗(yàn)以蓮藕為材料,在前人基礎(chǔ)上對(duì)多酚氧化酶基因進(jìn)行進(jìn)一步分子研究,對(duì)蓮藕酵母文庫(kù)及PPO基因誘餌載體進(jìn)行構(gòu)建,為后續(xù)運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)揭示蓮藕多酚氧化酶的互作蛋白及順式作用元件奠定基礎(chǔ),以期可以從根源上解決蓮藕褐變問(wèn)題并減少由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)為增強(qiáng)植株抗逆性研究打下基礎(chǔ)。通過(guò)本研究得到以下結(jié)果:1.采用CTAB-LiCl法提取蓮藕芽尖總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、膠回收、連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序等試驗(yàn)得到含有酶切位點(diǎn)NdeI和EcoRI的PPO基因。隨后將得到的PPO基因與pGBKT7載體連接得到重組質(zhì)粒pGBKT7-PPO,在使用雙酶切、測(cè)序等方法驗(yàn)證重組質(zhì)粒的準(zhǔn)確性之后將誘餌載體與AD共轉(zhuǎn)入AH109菌株中并涂布于SD缺陷型培養(yǎng)基上,發(fā)現(xiàn)其在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),在SD/-Trp-Leu-Ade-His培養(yǎng)基上沒(méi)有生長(zhǎng)說(shuō)明載體未發(fā)生自激活現(xiàn)象。最后挑取成功轉(zhuǎn)入pGBKT7-PPO及pGBKT7的AH109酵母菌株于YPDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),兩種菌液在600nm波長(zhǎng)處的OD值無(wú)顯著差異,說(shuō)明誘餌載體對(duì)宿主菌AH109未產(chǎn)生毒性,誘餌載體pGBKT7-PPO構(gòu)建成功。2.本試驗(yàn)采用Smart法構(gòu)建cDNA文庫(kù),首先使用試劑盒分別提取蓮藕芽尖、莖、葉的RNA,得到高質(zhì)量的RNA后將三者等質(zhì)量混合得到完整的蓮藕植株RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄及LD-PCR等方法合成ds cDNA并純化,獲得片段大小在500bp-3000bp范圍內(nèi)的ds cDNA,將純化后的ds cDNA與p GADT連接并轉(zhuǎn)化構(gòu)建cDNA文庫(kù)。最后對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量及污染檢測(cè),根據(jù)試驗(yàn)計(jì)算可知得到的cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量為7.5×106cfu,文庫(kù)滴度為7.5×1010 cfu/mL,轉(zhuǎn)化效率為2.5×106 cfu/μg,同時(shí)涂板檢測(cè)到收集的cDNA文庫(kù)菌液沒(méi)有污染,表明cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功,能夠滿足篩選目的蛋白及保存的需要。
【關(guān)鍵詞】：蓮藕 PPO 酵母雙雜交 誘餌載體 cDNA文庫(kù)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S645.1;Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1.1 蓮藕12-14
• 1.1.1 蓮藕概況12-13
• 1.1.2 蓮藕食用及藥用價(jià)值13-14
• 1.2 多酚氧化酶概述14-18
• 1.2.1 PPO基本情況14
• 1.2.2 PPO的定位與分布14-15
• 1.2.3 PPO的結(jié)構(gòu)15-16
• 1.2.4 PPO的生理作用16
• 1.2.5 酶促褐變機(jī)理16-17
• 1.2.6 PPO活性抑制方法概述17-18
• 1.3 酵母雙雜交系統(tǒng)18-22
• 1.3.1 酵母雙雜交系統(tǒng)概述18
• 1.3.2 酵母雙雜交系統(tǒng)的完善18-19
• 1.3.3 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用19-22
• 第二章 試驗(yàn)方案22-24
• 2.1 研究目的及意義22
• 2.2 研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線22-24
• 2.2.1 研究?jī)?nèi)容22-23
• 2.2.2 技術(shù)路線23-24
• 第三章 蓮藕酵母雙雜交誘餌載體PGBKT7-PPO的構(gòu)建與檢測(cè)24-37
• 3.1 材料與方法24-26
• 3.1.1 植物材料24
• 3.1.2 菌株及質(zhì)粒24
• 3.1.3 常用試劑及試劑盒24
• 3.1.4 引物合成與測(cè)序24
• 3.1.5 常用試劑及培養(yǎng)基的配制24-25
• 3.1.6 主要儀器設(shè)備25-26
• 3.2 試驗(yàn)方法26-31
• 3.2.1 蓮藕芽尖總RNA的提取（CTAB法）26
• 3.2.2 cDNA第一條鏈合成（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）26-27
• 3.2.3 對(duì)合成的cDNA質(zhì)量進(jìn)行初步檢測(cè)27
• 3.2.4 目的基因的克隆27-28
• 3.2.5 目的片段與T-vector PMD19（simple）的連接28
• 3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化28-29
• 3.2.7 菌落PCR檢測(cè)29
• 3.2.8 誘餌載體構(gòu)建29-31
• 3.3 結(jié)果分析31-35
• 3.3.1 RNA提取31
• 3.3.2 cDNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果31
• 3.3.3 蓮藕PPO基因PCR擴(kuò)增結(jié)果31-32
• 3.3.4 PMD19-T-PPO（simple）測(cè)序結(jié)果32-33
• 3.3.5 提取PMD19-T-PPO（simple）及pGBKT7質(zhì)粒與雙酶切結(jié)果33-34
• 3.3.6 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PPO提取及雙酶切鑒定結(jié)果34
• 3.3.7 AH109中重組子PGBKT7-PPO的毒性檢測(cè)及自激活試驗(yàn)34-35
• 3.4 討論35-37
• 第四章 蓮藕CDNA文庫(kù)的構(gòu)建37-45
• 4.1 材料與方法37-38
• 4.1.1 植物材料37
• 4.1.2 菌株及質(zhì)粒37
• 4.1.3 常用試劑及試劑盒37
• 4.1.4 常用試劑及培養(yǎng)基的配制37
• 4.1.5 引物37-38
• 4.1.6 主要儀器設(shè)備38
• 4.2 試驗(yàn)方法38-41
• 4.2.1 整株蓮藕RNA提取方法38
• 4.2.2 cDNA的合成38-40
• 4.2.3 酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建40-41
• 4.3 結(jié)果與分析41-44
• 4.3.1 整株蓮藕RNA提取結(jié)果41
• 4.3.2 ds cDNA的合成及純化結(jié)果41-43
• 4.3.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)量檢測(cè)43-44
• 4.4 討論44-45
• 第五章 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-56
• 附錄 156-58
• 附錄 258-59
• 縮略詞59-60
• 致謝60-61
• 作者簡(jiǎn)介61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：565071