本文關鍵詞：microRNAs和RPW8.1調控水稻稻瘟病抗性

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【摘要】：稻瘟病菌對全世界的水稻生產構成威脅,嚴重影響世界糧食安全,有關水稻與稻瘟病菌的互作機理是本領域研究熱點之一。miRNAs作為一種重要的調節(jié)因子,調節(jié)著植物生長發(fā)育、抗逆抗病等。之前,我們實驗室通過對感病材料LTH和抗病材料IRBLkm-Ts接種稻瘟病菌,用高通量測序檢測了侵染前后miRNAs的積累量。本實驗對其中三個miRNAs構建過表達株系,并檢測其對稻瘟病菌的抗性及其參與的抗性通路。主要取得了以下結果：接種稻瘟病菌后,miR169a的積累在感病材料LTH和抗病材料IRBLkm-Ts中均有明顯升高。對miR169a過表達植株進行滴菌和噴菌檢測,表現(xiàn)出對稻瘟病菌抗性減弱,用qRT-PCR方法檢測到OsRP10的轉錄水平明顯低于野生型上的轉錄水平。用flg22和chitin處理miR169a過表達植株發(fā)現(xiàn),基礎抗性標記基因OsKS4轉錄水平沒有被誘導起來,而OsNAC4的轉錄水平直到8hr時才達到較高的水平,因此推測miR169a對水稻早期的抗病并沒有太大影響。綜上所述,miR169a負調水稻稻瘟病抗性,但對水稻早期抗性沒有顯著抑制作用。MiR827a在LTH接菌48hr后,積累量達到0hr和12hr的10倍左右,而在抗病材料IRBLkm-Ts接菌12hr后,積累量與不接菌的對照相比,升高了3倍多。對miR827a過表達植株接菌后發(fā)現(xiàn),過表達植株較野生型表現(xiàn)出抗性增強,OsPR10基因在接菌48hr后,轉錄水平顯著高于野生型。用flg22和chitin處理miR827a過表達植株后發(fā)現(xiàn),在受到flg22處理后,基礎抗性標記基因OsNAC4和OsKS4的轉錄水平顯著高于對照材料TP309上的轉錄水平；在受到chitin誘導8hr后,基礎抗性標記基因OsNAC4的轉錄水平顯著高于對照材料TP309上的轉錄水平。上述結果提示miR827a通過正調PTI(早期)抗性和后期抗性來增強水稻對稻瘟病菌的抗性。MiR167d在LTH中的誘導表達量要高于IRBLkm-Ts。對miR167d過表達株系進行接菌鑒定,發(fā)現(xiàn)miR167d過表達植株較野生型更加感稻瘟病菌,同時OsPR10誘導轉錄水平明顯低于野生型中的轉錄水平。用flg22和chitin處理miR167d過表達植株后,檢測到OsKS4的轉錄水平與野生型中相比沒有明顯差異,但OsNAC4的轉錄水平則明顯高于野生型中的轉錄水平。因此我們推測miR167d負調控了水稻對稻瘟病菌的抗性,但miR167d對水稻的PTI反應有部分的促進作用。AtRPW8.1是擬南芥中的一個廣譜抗性蛋白。我們檢測了AtRPW8.1異源表達的轉基因水稻中RPW8.1對水稻稻瘟病抗性的影響。通過對T3代RPW8.1轉基因植株進行接菌鑒定,發(fā)現(xiàn)接菌后RPW8.1的轉錄水平和蛋白積累量都明顯提高,證明外源蛋白RPW8.1在水稻中可以受稻瘟病菌誘導表達�？共⌒澡b定發(fā)現(xiàn)轉基因水稻對稻瘟病菌表現(xiàn)明顯抗性,抗性標記基因OsPBZ1和OsPR10基因的轉錄也顯著高于對照材料中的轉錄水平,說明RPW8.1可以正調水稻稻瘟病抗性。進一步用flg22和chitin處理RPW8.1轉基因植株后,檢測到RPW8.1的轉錄水平和蛋白積累量明顯升高,同時基礎抗性標記基因OsNAC4的轉錄水平也明顯高于野生型中的轉錄水平。綜上所述,我們推斷RPW8.1可以在水稻中異源誘導表達,增強水稻對稻瘟病菌的抗性。
【關鍵詞】：水稻 稻瘟病抗性 RPW8.1 miRNAs PTI
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.41
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 1 文獻綜述10-19
• 1.1 植物免疫反應10-12
• 1.1.1 植物天然免疫反應10-11
• 1.1.2 植物系統(tǒng)獲得性抗性11-12
• 1.2 水稻與稻瘟病菌的互作12-15
• 1.2.1 稻瘟病的危害及其對水稻的侵染12-13
• 1.2.2 水稻與稻瘟病互作的分子機理13-15
• 1.3 MicroRNAs(miRNAs)的功能及其與植物免疫反應的相關性15-17
• 1.3.1 MiRNAs的合成及其功能15-16
• 1.3.2 MiRNAs對植物免疫反應的調節(jié)16
• 1.3.3 MiRNAs調控水稻稻瘟病抗性16-17
• 1.4 廣譜抗病蛋白RPW8.1的研究進展17-18
• 1.5 本論文選題的目的與意義18-19
• 2 材料與方法19-29
• 2.1 實驗材料19-21
• 2.1.1 水稻轉基因材料19
• 2.1.2 實驗所用稻瘟病菌菌株19
• 2.1.3 遺傳轉化所用的載體與菌株19
• 2.1.4 本實驗所用試劑19-20
• 2.1.5 實驗所用抗生素20
• 2.1.6 實驗所用培養(yǎng)基20
• 2.1.7 實驗所用儀器設備20-21
• 2.2 實驗方法21-29
• 2.2.1 水稻遺傳轉化21-23
• 2.2.2 對遺傳轉化產生的水稻植株進行陽性鑒定23-27
• 2.2.3 對水稻轉基因株系抗性鑒定27-29
• 3 結果與分析29-51
• 3.1 MiRNAs過表達載體的水稻遺傳轉化29-30
• 3.2 MiR169a調控水稻稻瘟病抗性分析30-36
• 3.2.1 MiR169a轉基因株系中miR169a的積累量分析30
• 3.2.2 MiR169a過表達植株中miR169a靶基因的轉錄水平分析30-32
• 3.2.3 MiR169a過表達株系抗病表型的分析32-33
• 3.2.4 MiR169a過表達株系噴菌后抗病表型的分析33-34
• 3.2.5 MiR169a對水稻抗性基因的調控34-35
• 3.2.6 MiR169a對水稻PTI的調控35-36
• 3.3 MiR827a調控水稻稻瘟病抗性的分析36-40
• 3.3.1 MiR827a轉基因株系中miR827a積累量的分析36
• 3.3.2 MiR827a過表達株系中miR827a靶基因的轉錄水平分析36-37
• 3.3.3 MiR827a過表達植株對稻瘟病抗病表型的鑒定37-38
• 3.3.4 MiR827a對水稻中抗性基因的調控38-39
• 3.3.5 MiR827a對PTI抗性的調控39-40
• 3.4 MiR167d對水稻稻瘟病抗性的調控分析40-45
• 3.4.1 MiR167d轉基因株系中miR167d的積累量分析40-41
• 3.4.2 MiR167d過表達植株中miR167d靶基因的表達量分析41-42
• 3.4.3 MiR167d過表達植株的稻瘟病抗病表型的鑒定與分析42-43
• 3.4.4 MiR167d對水稻中免疫相關基因的調控43-44
• 3.4.5 MiR167d對PTI抗性的調控44-45
• 3.5 RPW8.1對水稻稻瘟病抗性抗性的調控分析45-51
• 3.5.1 RPW8.1抗病株系的鑒定45-46
• 3.5.2 RPW8.1表達量與水稻稻瘟病抗性增強的相關性分析46-47
• 3.5.3 RPW8.1對水稻稻瘟病抗性基因的調控47-48
• 3.5.4 RPW8.1對PTI抗性的響應分析48-49
• 3.5.5 RPW8.1對水稻PTI抗性調控分析49-51
• 4 討論51-54
• 4.1 MiRNAs對水稻抗性的調節(jié)51-52
• 4.2 RPW8.1對水稻抗性的調節(jié)52-54
• 參考文獻54-66
• 致謝66-68
• 附錄68-69

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