本文關(guān)鍵詞：雞TBK1基因的克隆、表達(dá)及其對(duì)IRF3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：TBK1(別名T2K,NAK)是非經(jīng)典IκB激酶家族成員之一,具有諸多生物學(xué)功能,其中包括參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和先天免疫等,也是治療諸多疾病(神經(jīng)性炎癥、自身免疫疾病、腫瘤性疾病)以及控制病毒性感染的潛在藥物治療靶點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),TBK1是先天免疫模式識(shí)別受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的核心蛋白,在調(diào)控先天抗病原微生物免疫上具有重要的作用,但關(guān)于該基因是否在雞先天免疫中發(fā)揮作用,怎樣作用還未有報(bào)道。為此,本試驗(yàn)以雞TBK1為目標(biāo)基因,利用分子克隆技術(shù)對(duì)雞TBK1基因進(jìn)行了克隆；通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了雞TBK1基因在雞不同組織中的表達(dá)；選用SPF雞進(jìn)行了機(jī)體ALV-J攻毒試驗(yàn),檢測(cè)機(jī)體在抵御病毒過(guò)程中雞TBK1的表達(dá)量變化；以雞胚成纖維細(xì)胞為細(xì)胞模型,進(jìn)行細(xì)胞ALV-J刺激和polyI:C轉(zhuǎn)染試驗(yàn),檢測(cè)了細(xì)胞在病毒入侵過(guò)程中雞TBK1的表達(dá)量變化。獲得以下主要結(jié)果：(1)雞TBK1基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)為2190bp,編碼729個(gè)氨基酸；雞TBK1基因與其他鳥類和哺乳類的同源性均較高,在85%以上,在進(jìn)化上相對(duì)保守；雞TBK1具有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(激酶結(jié)構(gòu)域和泛素樣結(jié)構(gòu)域),位于該蛋白的氮端,且激酶結(jié)構(gòu)域具有兩個(gè)重要的位點(diǎn),ATP結(jié)合位點(diǎn)和第172為的絲氨酸位點(diǎn)。(2)雞TBK1基因在組織中廣泛表達(dá),且在免疫組織(脾、胸腺、法氏囊)中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P0.01)。(3)與對(duì)照組相比,SPF雞機(jī)體ALV-J攻毒組雞TBK1基因的mRNA表達(dá)量在脾臟、胸腺、法氏囊中顯著上升(P0.05或P0.01)；ALV-J和polyI:C刺激的雞胚成纖維細(xì)胞組雞TBK1基因的mRNA表達(dá)量也顯著上升(P0.01)；以上結(jié)果說(shuō)明TBKl參與雞機(jī)體以及雞細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。(4) ALV-J和polyI:C刺激的雞胚成纖維細(xì)胞中,IRF3、IFNβ和IFNα的表達(dá)量的顯著上升(P0.01)；與陰性對(duì)照(NC)相比,雞TBK1基因干擾細(xì)胞組的IRF3、IFNβ和IFNα的表達(dá)量受到了顯著的影響(P0.05或P0.01),上述結(jié)果說(shuō)明TBK1正調(diào)控IRF3、IFNβ和IFNα的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：雞 TBK1 克隆 表達(dá) 先天免疫
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S831
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 主要符號(hào)說(shuō)明8-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-24
• 1.1 IKB蛋白激酶家族簡(jiǎn)介11-12
• 1.2 TBK1的簡(jiǎn)介12-16
• 1.2.1 TBK1的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2.2 TBK1的活性的調(diào)節(jié)13-15
• 1.2.3 TBK1的主要功能15-16
• 1.3 TBK1在先天免疫中的主要作用16-22
• 1.3.1 TBK1在先天免疫模式識(shí)別受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用16-19
• 1.3.2 TBK1激活的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路19-21
• 1.3.3 TBK1的主要支架蛋白21-22
• 1.3.4 TBK1與病毒間的相互作用22
• 1.4 本試驗(yàn)的目的和意義22-24
• 2 材料與方法24-36
• 2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及病毒來(lái)源24
• 2.2 試驗(yàn)試劑與耗材24-26
• 2.2.1 主要試劑及試劑盒24-25
• 2.2.2 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.3 技術(shù)路線26-27
• 2.4 試驗(yàn)方法27-35
• 2.4.1 CDNA模板的制備27-28
• 2.4.2 TBK1基因的克隆28-31
• 2.4.3 機(jī)體試驗(yàn)31-32
• 2.4.4 細(xì)胞試驗(yàn)32-34
• 2.4.5 熒光定量PCR34-35
• 2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析35-36
• 3 結(jié)果與分析36-53
• 3.1 雞TBK1基因的生物信息學(xué)分析36-41
• 3.1.1 雞TBK1基因CDS區(qū)的克隆36
• 3.1.2 雞TBK1的核酸氨基酸序列及同源性分析36-38
• 3.1.3 TBK1的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析38-40
• 3.1.4 TBK1的多序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建40-41
• 3.2 機(jī)體誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果41-46
• 3.2.1 RNA提取效果的檢測(cè)41-42
• 3.2.2 目的基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線42-44
• 3.2.3 雞TBK1基因的組織表達(dá)譜44
• 3.2.4 ALV-J病毒感染不同組織TBK1基因的差異表達(dá)44-46
• 3.3 細(xì)胞病毒誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果46-49
• 3.3.1 雞胚成纖維細(xì)胞ALV-J病毒處理后相關(guān)基因的差異表達(dá)46-48
• 3.3.2 雞胚成纖維細(xì)胞POLYI：C轉(zhuǎn)染后相關(guān)基因的差異表達(dá)48-49
• 3.4 TBK1基因細(xì)胞干擾試驗(yàn)結(jié)果49-53
• 3.4.1 SIRNA對(duì)TBK1基因的干擾效率49-50
• 3.4.2 SIRNA干擾對(duì)ALV-J刺激下TBK1及其下游基因表達(dá)的影響50-51
• 3.4.3 SIRNA干擾對(duì)POLYI：C刺激下TBK1及其下游基因表達(dá)的影響51-53
• 4 討論53-58
• 4.1 雞TBK1基因的克隆及其分子特征分析53-54
• 4.2 TBK1基因的組織表達(dá)譜分析54
• 4.3 TBK1基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析54-56
• 4.3.1 ALV-J刺激下TBK1基因在機(jī)體上的差異表達(dá)54-55
• 4.3.2 ALV-J刺激下TBK1基因在細(xì)胞中差異表達(dá)55-56
• 4.3.3 POLYI：C刺激下TBK1基因在細(xì)胞中差異表達(dá)56
• 4.4 TBK1對(duì)IRF3、IFNB和IFNA的影響56-58
• 5 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 致謝66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與授權(quán)專利67

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本文編號(hào)：435523