本文關(guān)鍵詞：川芎COMT基因序列的克隆、分析、表達(dá)及功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)為我國中醫(yī)傳統(tǒng)藥物中的一種常用藥物,有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效。其中阿魏酸為其指標(biāo)成分和主要活性成分。阿魏酸的生物合成途徑中以咖啡酸甲基化生成阿魏酸為主要調(diào)控步驟,其中咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)在其中起著很重要的作用。從川芎轉(zhuǎn)錄組中篩選出了一條同源性較高的COMT序列。通過RACE技術(shù)擴(kuò)增出序列的全長序列。序列全長1171bp,翻譯362aa的蛋白,命名為C4-COMT (GenBank accession no.KR106206)。蛋白基本性質(zhì)分析結(jié)果顯示,C4-COMT蛋白分子量為39.932kDa,等電點(diǎn)為5.95。對其蛋白親疏水、信號肽、亞細(xì)胞定位分析顯示,蛋白為偏親水性蛋白,無信號肽,亞細(xì)胞定位可能在細(xì)胞質(zhì)。通過與其他8條已知COMT氨基酸序列進(jìn)行序列比對分析,找到了COMT蛋白保守的7個(gè)基序,以及COMT催化的關(guān)鍵氨基酸殘基。與其他49種物種已知的COMT一起構(gòu)建進(jìn)化樹,聚類發(fā)現(xiàn)COMT在進(jìn)化過程中趨于保守。其中川芎C4-COMT蛋白與同為傘形科植物的大阿米芹關(guān)系最近,歸為一類,而與原核生物中的香蕉枯萎病菌關(guān)系最遠(yuǎn)。對序列的密碼子偏好性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)序列的密碼子偏好性與大腸桿菌的密碼子偏好性差異不大。預(yù)測了蛋白二級結(jié)構(gòu)同時(shí)根據(jù)同源建模法以紫花苜宿COMT為模板構(gòu)建了蛋白的三維模型。通過PCR、雙酶切、連接技術(shù)構(gòu)建COMT-pET28a重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21菌體中,構(gòu)建重組菌株。重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)了COMT重組蛋白。對重組菌株的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了重組菌株表達(dá)的最佳溫度為37℃、最佳IPTG濃度為2mM、最佳表達(dá)時(shí)間4h。重組蛋白的可溶性研究發(fā)現(xiàn)重組蛋白可溶于水,說明蛋白未形成包涵體。采用Ni2+親和柱層析分離純化重組COMT蛋白,得到純化后的COMT蛋白,并對蛋白的濃度進(jìn)行了測定。在pH7,37℃的條件下,進(jìn)行酶促反應(yīng),采用高效液相色譜檢測酶活性。應(yīng)用反相柱層析對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化產(chǎn)物經(jīng)1HNMR結(jié)構(gòu)鑒定為阿魏酸。對酶的最適反應(yīng)條件進(jìn)行了研究,確定了重組COMT蛋白的最適溫度和最適pH分別為37℃,pH7,為重組蛋白的體外應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。對預(yù)測的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行點(diǎn)突變研究,驗(yàn)證了參與COMT蛋白催化的關(guān)鍵氨基酸殘基。
【關(guān)鍵詞】：川芎 COMT 生物信息學(xué)分析 原核表達(dá) 酶活性 阿魏酸
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S567.239;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第1章 緒論9-24
• 1.1 川芎簡介9-12
• 1.2 川芎的功效12-13
• 1.3 阿魏酸13-17
• 1.4 阿魏酸的生物合成途徑17-19
• 1.5 咖啡酸-0-甲基轉(zhuǎn)移酶19-22
• 1.6 課題的研究內(nèi)容、技術(shù)路線及創(chuàng)新點(diǎn)22-24
• 第2章 川芎COMT基因的克隆及生物信息學(xué)分析24-45
• 2.1 材料與方法24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2.3 結(jié)果分析28-31
• 2.4 川芎COMT的生物信息學(xué)分析31-44
• 2.5 本章小結(jié)44-45
• 第3章 川芎COMT的原核表達(dá)及酶活鑒定45-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法46-52
• 3.3 結(jié)果與分析52-64
• 3.4 本章小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-67
• 致謝67-68
• 參考文獻(xiàn)68-76
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及科研成果76

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