本文關(guān)鍵詞：FoxO1調(diào)控鵝原代肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：肝臟在維持機(jī)體糖脂代謝平衡中起重要作用。近年來,叉頭框蛋白1(F oxO1)成為研究胰島素抵抗,肥胖以及2型糖尿病的熱點(diǎn)基因,暗示其在脂質(zhì)代謝中存在作用。本實(shí)驗(yàn)以鵝原代肝細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,通過轉(zhuǎn)染FoxO1干擾質(zhì)粒,添加胰島素以及NVP-BEZ235處理鵝肝細(xì)胞,采用熒光定量PCR法、western blot蛋白檢測法,Elisa試劑盒檢測法以及油紅O染色法檢測脂肪酸合成,VLDL-TG分泌轉(zhuǎn)運(yùn)以及脂肪酸氧化途徑的相關(guān)指標(biāo)來反映脂質(zhì)代謝的變化,分析胰島素通過FoxO1調(diào)控鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用,探討FoxO1對肝臟脂質(zhì)代謝的作用是否是由PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)的,以期進(jìn)一步闡明轉(zhuǎn)錄因子FoxO1在鵝肝臟脂質(zhì)代謝過程中的作用,為探討胰島素、PI3K-Akt信號通路以及FoxO1在肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝作用的分子機(jī)制及其對基因水平的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。結(jié)果：1、轉(zhuǎn)染pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-FoxO1質(zhì)粒24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)總FoxO1蛋白含量顯著下調(diào),熒光定量PCR檢測顯示FoxO1干擾效率達(dá)51.2%,表明干擾FoxO1表達(dá)成功。2、胰島素處理肝細(xì)胞使FoxO1磷酸化增加,mRNA表達(dá)量減少進(jìn)而其活性降低,相反NVP-BEZ235處理使FoxO1基因mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量增加(P0.05),表明胰島素能抑制FoxO1活性而NVP-BEZ235使FoxO1活性增加。3、FoxO1干擾能顯著降低Akt的mRNA的表達(dá)水平,而增加mTORc1的mRNA表達(dá)水平(P0.05)；western blot檢測結(jié)果顯示FoxO1干擾能降低Akt的磷酸化水平,增加mTORc1的蛋白表達(dá),表明FoxO1能調(diào)節(jié)Akt和mTORc1基因的表達(dá)。4、鵝肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染FoxO1干擾質(zhì)粒后,FAS、ACCα、CPT1、ACOX1、MTP、ApoB基因mRNA表達(dá)量和激酶表達(dá)量于對照組顯著減少(P0.05),DGAT1表達(dá)量增加,其中,SREBP1、DGAT2、PPARa和PPARy基因mRNA表達(dá)量與對照組無明顯差異(P0.05)。Western blot檢測ACCα、CPT1、MTP蛋白含量顯示,FoxO1干擾后ACCα和MTP蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組,CPT1則無顯著變化。油紅O染色顯示鵝肝細(xì)胞干擾FoxO1使細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒增多,脂質(zhì)沉積明顯,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)外TG含量增加,而胞外VLDL含量減少。5、胰島素處理鵝肝細(xì)胞后CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARa和PPARy基因m RNA表達(dá)量降低,同時(shí)增加了ACCaα、FAS、SREBP1、DGAT1和DGAT1基因的表達(dá),同時(shí)western blot和Elisa檢測CPT1和MTP均顯示出與mRNA表達(dá)水平類似的結(jié)果。同時(shí),油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴增多。另外,在胰島素處理肝細(xì)胞后轉(zhuǎn)染FoxO1干擾質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARa和PPARγ基因m RNA表達(dá)量也顯著低于對照組且比單獨(dú)的胰島素處理更為明顯(P0.05),然而,S REBP1和DGAT1的表達(dá)量增加,ACCa和FAS基因的mRNA表達(dá)量則與對照組無顯著差異；此外,檢測細(xì)胞內(nèi)外TG含量發(fā)現(xiàn)均高于對照組,而細(xì)胞外VLDL含量減少；同時(shí)油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脂滴顆粒增多,脂質(zhì)沉積增加。6、鵝肝細(xì)胞經(jīng)過NVP-BEZ235處理阻斷PI3K-Akt-mTORc1信號通路后,發(fā)現(xiàn)ACC α、FAS、SREBP1、DGAT1和DGAT1基因的表達(dá)量降低,CPT1、ACOX1、MTP、 ApoB、PPARa和PPARy基因mRNA表達(dá)量增加(P0.05)。油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒明顯減少,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)外的TG含量減少,胞外VLDL含量增加。然而,在NVP-BEZ235處理阻斷PI3K-Akt1-mTORc1信號通路后繼續(xù)轉(zhuǎn)染FoxO1干擾質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)ACCα、FAS、SREBP1、DGAT1、DGAT2、CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、P PARa和PPARy基因mRNA表達(dá)量均與對照組無顯著變化,細(xì)胞內(nèi)脂滴含量也趨于正常水平。
【關(guān)鍵詞】：鵝肝原代細(xì)胞 FoxO1 PI3K-Akt通路 脂質(zhì)代謝 胰島素
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S835
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 常用詞語英文縮寫10-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-20
• 1.1 FoxO1概述13-14
• 1.2 FoxO1與胰島素的關(guān)系14-15
• 1.3 FoxO1與PI3K-Akt-mTORc1通路的關(guān)系15-16
• 1.4 FoxO1與脂質(zhì)代謝研究進(jìn)展16-18
• 1.5 PI3K-Akt通路與脂質(zhì)代謝18-19
• 1.6 本研究的目的及意義19-20
• 2 材料與方法20-34
• 2.1 試驗(yàn)材料20-23
• 2.1.1 試驗(yàn)樣品20
• 2.1.2 主要藥品和試劑20-23
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-34
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成23-24
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)24-26
• 2.2.3 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性26
• 2.2.4 脂滴油紅O染色26-27
• 2.2.5 總RNA提取及質(zhì)量檢測27-28
• 2.2.6 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)28-29
• 2.2.7 熒光定量PCR29-30
• 2.2.8 FAS、ACCα、CPT1、TG、VLDL酶活性檢測30-31
• 2.2.9 Western Blot檢測基因蛋白表達(dá)31-33
• 2.2.10 pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-FoxO1甘油菌的擴(kuò)繁、質(zhì)粒抽提及鑒定33-34
• 2.2.11 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析34
• 3 試驗(yàn)結(jié)果34-61
• 3.1 鵝FoxO1基因miRNA干擾載體構(gòu)建及篩選34-38
• 3.1.1 miRNA干擾載體的構(gòu)建34-36
• 3.1.2 最佳干擾序列及干擾時(shí)間的篩選36-38
• 3.2 鵝肝細(xì)胞FoxO1干擾對PI3K-Akt-mTOR1信號途徑及脂質(zhì)代謝的影響38-43
• 3.2.1 FoxO1干擾對PI3K-Akt-mTORc1信號途徑的影響38-39
• 3.2.2 FoxO1干擾對脂肪酸合成的影響39-41
• 3.2.3 鵝肝細(xì)胞FoxO1干擾對脂肪酸氧化的影響41-42
• 3.2.4 鵝肝細(xì)胞FoxO1干擾對VLDL-TG組裝分泌的影響42-43
• 3.3 胰島素和NVP-BEZ235對PI3K-AKT-mTORc1信號通路表達(dá)的影響43-44
• 3.4 胰島素和NVP-BEZ235對FoxO1表達(dá)活性的影響44-46
• 3.4.1 胰島素對FoxO1表達(dá)活性的影響44-45
• 3.4.2 NVP-BZE235抑制PI3K-Akt1-mTORc1信號通路對FoxO1的影響45-46
• 3.5 胰島素通過FoxO1調(diào)節(jié)鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝作用研究46-53
• 3.5.1 胰島素處理并干擾FoxO1對脂肪酸合成的影響46-49
• 3.5.2 胰島素處理并干擾FoxO1對肝細(xì)胞脂肪氧化基因表達(dá)的影響49-50
• 3.5.3 胰島素處理并干擾FoxO1對肝細(xì)胞VLDL-TG組裝分泌的影響50-53
• 3.6 PI3K-Akt-mTOR1信號途徑通過FoxO1調(diào)控鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用研究53-61
• 3.6.1 NVP-BEZ235處理同時(shí)干擾FoxO1對脂肪酸合成影響53-57
• 3.6.2 NVP-BEZ235處理細(xì)胞同時(shí)干擾FoxO1對脂肪酸氧化基因表達(dá)的影響57-59
• 3.6.3 NVP-BEZ235處理細(xì)胞同時(shí)干擾FoxO1對VLDL-TG組裝分泌的影響59-61
• 4 討論61-66
• 4.1 轉(zhuǎn)錄因子FoxO1與PI3K-Akt信號通路的調(diào)控關(guān)系61-62
• 4.1.1 鵝肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子FoxO1對PI3K-Akt-mTORc1信號通路的影響61-62
• 4.1.2 PI3K-Akt-mTORc1信號通路調(diào)節(jié)FoxO1的活性62
• 4.2 轉(zhuǎn)錄因子FoxO1與脂質(zhì)代謝關(guān)鍵途徑的調(diào)控關(guān)系62-64
• 4.3 胰島素通過FoxO1調(diào)控鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的機(jī)理分析64-65
• 4.4 PI3K-Akt通路通過FoxO1調(diào)控鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的機(jī)理分析65-66
• 5 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 致謝73-74
• 碩士研究生學(xué)習(xí)期間發(fā)表文章情況74

【相似文獻(xiàn)】

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1 杜榮,秦健,王俊東;動(dòng)物脂質(zhì)代謝調(diào)控的關(guān)鍵及其研究進(jìn)展[J];動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué);2002年10期

2 楊霞;韓春春;;PI3K-Akt-mTORC1信號途徑在脂質(zhì)代謝中的作用[J];飼料研究;2014年09期

3 劉衛(wèi)國;李紹鈺;戴玉瑞;;多不飽和脂肪酸對家禽脂質(zhì)代謝影響的研究進(jìn)展[J];中國飼料;2009年24期

4 袁運(yùn)生;張夕原;嚴(yán)德s

本文編號：417440