本文關(guān)鍵詞：H5和H7亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種人獸共患傳染病,呈世界性的存在和發(fā)生。其宿主范圍十分廣泛,主要宿主為水生禽類,同時也可以感染哺乳動物和人類。一般情況下,禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)并不感染人類,但自1997年發(fā)生H5N1亞型禽流感病毒感染人類事件之后,相繼有不同亞型禽流感病毒感染人病例出現(xiàn)。尤其是2013年H7N9亞型流感病毒在我國的流行,不僅給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失,同時造成多起人類感染該病毒死亡的事件。因此,及時開展針對流感病毒的診斷研究,對防止流感大范圍流行,降低對動物及人類生命安全的危害具有重要意義。熒光定量RT㧟PCR技術(shù)(Real-time RT-PCR)是一種新型的分子核酸檢測技術(shù)。本研究借助實驗室已有工作平臺,建立了可以檢測H5和H7亞型禽流感病毒的熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)H5N1亞型流感病毒HA和H7N9亞型流感病毒HA和NA基因序列,設(shè)計并合成相關(guān)探針和引物,建立了檢測H5和A型流感病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR和H7N9亞型及A型流感病毒三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法。用背景清楚的H1~H16、N1~N9亞型A型流感病毒和多種其它病原評價兩種方法,均表現(xiàn)出了較好的特異性;在敏感性試驗中,檢測10倍系列稀釋的H5N1和H7N9亞型病毒尿囊液的最高稀釋度可以達(dá)到10-5;在重復(fù)性試驗中,兩種方法Cp值變異系數(shù)均2%,重復(fù)性較好;經(jīng)過分析大量臨床拭子的檢測結(jié)果,該檢測方法與病毒分離鑒定的符合度較高。獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于獸用微生物及其產(chǎn)物的定性鑒定或定量測定動物疫病診斷試劑及獸用生物制品生物效價等特性值或驗證檢驗和診斷方法準(zhǔn)確性的參考品。本研究利用H5N1和H7N9亞型滅活病毒制備了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),在熱穩(wěn)定性試驗中,分別在-20℃、4℃、37℃不同溫度下保存一定時間,仍可以表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性;在反復(fù)凍融試驗中,經(jīng)過反復(fù)16次凍融之后仍可以作為參考標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較為穩(wěn)定;無菌試驗鑒定符合要求,同時標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滅活充分,可以為普通RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測方法提供參考。
【關(guān)鍵詞】：禽流感 熒光定量RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 英文縮略表9-10
• 第一章 引言10-18
• 1.1 禽流感病毒綜述10-13
• 1.1.1 AIV的組成結(jié)構(gòu)10-11
• 1.1.2 AIV主要蛋白11-13
• 1.2 AI流行概況13-14
• 1.2.1 H5亞型AI的流行及危害13
• 1.2.2 新型H7N9流感病毒的出現(xiàn)13-14
• 1.3 AIV的診斷14-16
• 1.3.1 病毒分離與鑒定14
• 1.3.2 血清學(xué)檢測方法14-15
• 1.3.3 分子生物學(xué)檢測方法15-16
• 1.4 生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)概述16-17
• 1.4.1 基本定義16-17
• 1.4.2 分類17
• 1.4.3 作用17
• 1.5 研究的目的和意義17-18
• 第二章 H5和H7亞型AIV熒光定量RT-PCR檢測方法的建立18-30
• 2.1 試驗材料18-20
• 2.1.1 病毒18-19
• 2.1.2 試劑19
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備19-20
• 2.2 試驗方法20-22
• 2.2.1 設(shè)計引物和探針20
• 2.2.2 病毒核酸提取20-21
• 2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品核酸RNA濃度的測定及拷貝數(shù)計算21
• 2.2.4 熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化21
• 2.2.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和病毒的定量21-22
• 2.2.6 性能評估22
• 2.3 試驗結(jié)果22-29
• 2.3.1 熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果22
• 2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制22-25
• 2.3.3 性能評估25-29
• 2.4 討論29-30
• 第三章 H5和H7亞型AIV核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備30-40
• 3.1 試驗材料30
• 3.1.1 病毒30
• 3.1.2 試劑30
• 3.2 試驗方法30-32
• 3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)半成品的制備與檢驗30-31
• 3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選品的制備與檢驗31
• 3.2.3 病毒核酸的提取31-32
• 3.2.4 穩(wěn)定性試驗32
• 3.3 試驗結(jié)果32-39
• 3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)半成品的制備與檢驗結(jié)果32-33
• 3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選品的制備與檢驗結(jié)果33
• 3.3.3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果33-39
• 3.4 討論39-40
• 第四章 全文結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-47
• 致謝47-48
• 作者簡歷48

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 丁麗霞;周海鈞;;生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究和技術(shù)要求(上)[J];中國藥師;2007年03期

  本文關(guān)鍵詞：H5和H7亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：365065