本文關(guān)鍵詞：牙鲆（Paralichthys olivaceus）TRAF6基因和TAK1基因的克隆及免疫應(yīng)答研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牙鲆(Paralichthys olivaceus)為冷溫性底棲魚(yú)類,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。近年來(lái),隨著高密度集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,魚(yú)類疾病的傳染也日益嚴(yán)重,養(yǎng)殖場(chǎng)中魚(yú)類大規(guī)模的死亡及其造成的重大經(jīng)濟(jì)損失給人工養(yǎng)殖提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此,深入研究牙鲆的抗病免疫機(jī)制,探尋增強(qiáng)養(yǎng)殖品種免疫力的途徑和方法,培育牙鲆抗病新品系,對(duì)于牙鲆養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大十分重要。Toll樣受體(TLRs)可識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs),是模式識(shí)別受體(PRRs)家族中的成員,在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。TLRs識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的配體后,可激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的分泌和共刺激分子的表達(dá),啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。TRAF6和TAK1是Toll樣受體信號(hào)通路中兩個(gè)重要的接頭蛋白,可激活下游信號(hào)通路,啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答反應(yīng)和特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究克隆到了TRAF6基因和TAK1基因的cDNA全長(zhǎng),并對(duì)其蛋白序列、調(diào)控區(qū)域及表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析,為進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理提供了理論依據(jù)。牙鲆TRAF6基因cDNA全長(zhǎng)1953 bp,包括1713 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),159 bp的5'UTR和81 bp的3'UTR,預(yù)測(cè)該基因編碼570個(gè)氨基酸。利用在線軟件分析了牙鲆TRAF6基因的蛋白結(jié)構(gòu)域,包括N端的RING結(jié)構(gòu)域,兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,一個(gè)環(huán)-環(huán)(coiled-coil)a螺旋結(jié)構(gòu)域以及高度保守的MATH結(jié)構(gòu)域。牙鲆TRAF6與巨石斑魚(yú)TRAF6的一致性高達(dá)91%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,牙鲆TRAF6和半滑舌鰨TRAF6聚為一支,親緣關(guān)系最近。對(duì)其調(diào)控區(qū)進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)存在豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),多為參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,預(yù)示了他們?cè)诿庖邞?yīng)答反應(yīng)中的潛在功能。熒光定量PCR結(jié)果顯示牙鲆TRAF6基因廣泛的表達(dá)于各組織中,但其表達(dá)量存在顯著的差異,在腸和心臟中有較高的表達(dá)。TRAF6在腸等免疫器官中的高表達(dá),與其在Toll樣受體信號(hào)通路中的重要作用是一致的。對(duì)牙鲆早期胚胎發(fā)育不同時(shí)期TRAF6基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,TRAF6基因在所有時(shí)期都有表達(dá),包括未受精卵,提示了TRAF6基因的母源性表達(dá)。免疫分子母源性mRNA的存在可能參與發(fā)育過(guò)程,也可能參與構(gòu)建免疫體系,以保護(hù)胚胎或仔魚(yú)免受病原體的侵襲。免疫刺激實(shí)驗(yàn)表明,LPS、poly I:C和CpG ODN都可以上調(diào)TRAF6基因的表達(dá)。牙鲆TAK1基因cDNA全長(zhǎng)2086 bp,其中包括ORF 1728 bp,5'UTR 232 bp, 3'UTR 128 bp,根據(jù)其完整的ORF預(yù)測(cè)TAK1基因編碼575個(gè)氨基酸殘基的蛋白。牙鲆TAK1基因與其他物種的一致性很高,與點(diǎn)帶石斑魚(yú)的一致性高達(dá)97%。牙鲆TAK1蛋白包括一個(gè)蛋白激酶ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域,一個(gè)絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶激活結(jié)構(gòu)域以及羧基端的環(huán)-環(huán)(coiled-coil) a螺旋結(jié)構(gòu)域。對(duì)其調(diào)控區(qū)進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)存在豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),多為參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,預(yù)示了他們?cè)诿庖邞?yīng)答反應(yīng)中的潛在功能。熒光定量PCR結(jié)果顯示牙鲆TAK1基因在所檢測(cè)的所有組織中都有表達(dá),但其表達(dá)量存在明顯的差異,在腸和心臟中有較高的表達(dá)。對(duì)牙鲆早期胚胎發(fā)育不同時(shí)期TAK1基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,TAK1基因在所有時(shí)期都有表達(dá),包括未受精卵,提示了TAK1基因的母源性表達(dá)。免疫分子母源性mRNA的存在可能參與發(fā)育過(guò)程,也可能參與構(gòu)建免疫體系,以保護(hù)胚胎或仔魚(yú)免受病原體的侵襲。免疫刺激實(shí)驗(yàn)表明,LPS、polyI:C和CpG ODN都可以上調(diào)TAK1基因的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：牙鲆 TRAF6 TAK1 基因克隆 啟動(dòng)子 表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-28
• 第一節(jié) Toll樣受體信號(hào)通路研究進(jìn)展13-20
• 1 Toll樣受體的結(jié)構(gòu)及其功能13-14
• 2 TLRs識(shí)別的配體14-16
• 3 Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑16-17
• 4 TLRs的生物學(xué)功能17-18
• 5 Toll樣受體與疾病18-19
• 6 Toll樣受體在魚(yú)類中的研究進(jìn)展19-20
• 第二節(jié) TRAF6基因簡(jiǎn)介20-23
• 1 TRAF簡(jiǎn)述20-21
• 2 TRAF的生物學(xué)功能21-22
• 3 TRAF622-23
• 第三節(jié) TAK1基因簡(jiǎn)介23-27
• 1 TAK1的結(jié)構(gòu)23-24
• 2 TAK1激酶活化反應(yīng)24-25
• 3 TAK1激酶失活反應(yīng)25
• 4 TAK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路25-26
• 5 TAK1與細(xì)胞凋亡26-27
• 第四節(jié) 本研究的目的、意義及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)27-28
• 第二章 牙鲆TRAF6基因的克隆及表達(dá)分析28-47
• 引言28-29
• 1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及取材29-30
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)引物30-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-37
• 2.1 總RNA的提取、檢測(cè)、純化和反轉(zhuǎn)錄31-32
• 2.2 牙鲆TRAF6基因核心片段的獲得32-33
• 2.3 TRAF6基因cDNA全長(zhǎng)的獲得33-34
• 2.4 牙鲆TRAF6基因及蛋白序列分析34-35
• 2.5 牙鲆TRAF6啟動(dòng)子區(qū)序列分析35
• 2.6 牙鲆TRAF6基因的組織差異性表達(dá)35-36
• 2.7 牙鲆TRAF6基因不同發(fā)育時(shí)期的差異性表達(dá)36
• 2.8 免疫刺激后基因表達(dá)的變化36-37
• 3 結(jié)果37-43
• 3.1 牙鲆TRAF6基因全長(zhǎng)的獲得37-39
• 3.2 牙鲆TRAF6基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析39-40
• 3.3 牙鲆TRAF6基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析40-41
• 3.4 牙鲆TRAF6基因的組織表達(dá)分析41
• 3.5 牙鲆TRAF6基因的早期胚胎發(fā)育表達(dá)分析41-42
• 3.6 免疫刺激后牙鲆TRAF6基因的表達(dá)變化42-43
• 4 討論43-47
• 第三章 牙鲆TAK1基因的克隆及表達(dá)分析47-60
• 引言47-48
• 1 材料與方法48-50
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及取材48
• 1.2 實(shí)驗(yàn)所用引物48-49
• 1.3 牙鲆TAK1基因核心片段的獲得49
• 1.4 牙鲆TAK1基因3’和5’末端的獲得49
• 1.5 牙鲆TAK1基因及蛋白序列分析49
• 1.6 牙鲆TAK1基因啟動(dòng)子區(qū)的獲得和分析49-50
• 1.7 牙鲆TAK1基因的組織差異性表達(dá)50
• 1.8 牙鲆TAK1基因不同發(fā)育時(shí)期的差異性表達(dá)50
• 1.9 免疫刺激后TAK1基因表達(dá)的變化50
• 2 結(jié)果50-57
• 2.1 牙鲆TAK1基因全長(zhǎng)分析結(jié)果50-53
• 2.2 牙鲆TAK1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析53-54
• 2.3 牙鲆TAK1基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析54
• 2.4 牙鲆TAK1基因的組織表達(dá)分析54-55
• 2.5 牙鲆TAK1基因的早期胚胎發(fā)育表達(dá)分析55
• 2.6 免疫刺激后牙鲆TAK1基因的表達(dá)變化55-57
• 3 討論57-60
• 參考文獻(xiàn)60-70
• 致謝70-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

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8 張文;張p

本文編號(hào)：365001