本文關(guān)鍵詞：舞毒蛾Ⅰ型幾丁質(zhì)酶基因催化區(qū)截短和定點突變的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：舞毒蛾遍及世界各地,對林業(yè)造成了極其嚴重的威脅。對舞毒蛾的防治可以從多個方向著手,目前大致包括性信息素誘導(dǎo)等生物方向防治,還有人工收集蟲卵等人工防治以及最為傳統(tǒng)的農(nóng)藥噴灑等的化學(xué)治理。在近幾年里,利用生物方法對舞毒蛾進行防治越來越受到人們的關(guān)注。在舞毒蛾的表皮以及中腸圍食膜中都存在大量的幾丁質(zhì),它是一種由β-1,4糖苷鍵連接多個N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)形成的線性多糖,在昆蟲的生長和發(fā)育過程中,幾丁質(zhì)周期性的產(chǎn)生和降解對其生長發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用。幾丁質(zhì)酶可以降解幾丁質(zhì),生物防治就是利用這一機制,本課題通過對舞毒蛾幾丁質(zhì)酶基因催化區(qū)的截短和定點突變做相關(guān)研究,深入分析幾丁質(zhì)酶催化其底物幾丁質(zhì)降解的催化機制,為更加深入的利用其高效的殺蟲提供相應(yīng)的理論方面支持。本研究首先將舞毒蛾I型幾丁質(zhì)酶基因(LdCHT5)利用PCR技術(shù)進行催化區(qū)截短和定點突變,得到四種催化區(qū)截短基因分別為LdCHT5-N20, LdCHT5-N60, LdCHT5-C20, LdCHT5-C60,以及六種催化區(qū)定點突變基因,LdCHT5-D143A, LdCHT5-D143E, LdCHT5-D143N, LdCHT5-D145A, LdCHT5-D145E, LdCHT5-D145N。并將這些基因都連接到一個用于真核表達的載體中,再利用Bac to Bac表達系統(tǒng),獲得含各目的基因的相應(yīng)穿梭載體Bacmid-LdCHT5-N20,Bacmid-LdCHT5-N60,Bacmid-LdCHT5-N20, Bacmid-LdCHT5-N60,Bacmid-LdCHT5-D143A,Bacmid-LdCHT5-D143E,Bacmid-LdCHT5-D143N, Bacmid-LdCHT5-D145A, Bacmid-LdCHT5-D145E, Bacmid-LdCHT5-D145N),利用轉(zhuǎn)染試劑cellfectin reagent將其轉(zhuǎn)染到草地貪夜蛾細胞Sf9中,進而表達目的蛋白。兩類蛋白的純化方式都是通過將粗蛋白過Ni-NTA鎳柱做相應(yīng)的純化,經(jīng)除雜純化以后的各蛋白可以為下一步更深層次的研究相應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)提供基礎(chǔ)。對蛋白酶學(xué)活性的研究利用CM-chitin-RBV為底物,研究表明,催化區(qū)截短的四種蛋白均沒有酶活,不利于后續(xù)實驗。而定點突變后的催化區(qū)相關(guān)實驗結(jié)果顯示：在六個突變體中,D143N具有較高的活性,D143E次之,分別保留了野生型酶活的84%,65%。D145E, D145N喪失了一半以上的酶活,而D143A, D145A相對于野生型幾丁質(zhì)酶來說幾乎失去90%以上的酶活。
【關(guān)鍵詞】：舞毒蛾 幾丁質(zhì)酶 截短 定點突變 真核表達系統(tǒng) 酶學(xué)活性
【學(xué)位授予單位】：太原理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S763.42
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-12
• 第一章 緒論12-24
• 1.1 舞毒蛾12-15
• 1.1.1 舞毒蛾分布12
• 1.1.2 舞毒蛾的防治12-15
• 1.2 幾丁質(zhì)15-17
• 1.2.1 幾丁質(zhì)的分布15-16
• 1.2.2 幾丁質(zhì)的分類16
• 1.2.3 幾丁質(zhì)的生物合成16
• 1.2.4 幾丁質(zhì)的化學(xué)合成16-17
• 1.2.5 幾丁質(zhì)的功能17
• 1.3 幾丁質(zhì)酶17-19
• 1.3.1 幾丁質(zhì)酶的分布17
• 1.3.2 幾丁質(zhì)酶的分類17-18
• 1.3.3 幾丁質(zhì)酶酶活的測定方法18
• 1.3.4 幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用18-19
• 1.4 昆蟲幾丁質(zhì)酶19-20
• 1.4.1 昆蟲幾丁質(zhì)酶的分布19
• 1.4.2 昆蟲幾丁質(zhì)酶分類19-20
• 1.4.3 昆蟲幾丁質(zhì)酶的功能20
• 1.5 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)20-21
• 1.6 定點突變21-22
• 1.6.1 定點突變概述21
• 1.6.2 實驗中用到的的定點突變技術(shù)21-22
• 1.6.3 定點突變的潛在應(yīng)用22
• 1.7 本論文研究的目的及意義22-23
• 1.7.1 催化區(qū)截短的研究22-23
• 1.7.2 催化區(qū)定點突變的研究23
• 1.8 本研究課題的主要來源和主要內(nèi)容23-24
• 第二章 表達載體構(gòu)建24-44
• 2.1 引言24
• 2.2 實驗材料24-27
• 2.2.1 實驗菌株及載體24-25
• 2.2.2 實驗試劑25-26
• 2.2.3 相關(guān)溶液的配置26-27
• 2.2.4 實驗儀器27
• 2.3 實驗方法27-37
• 2.3.1 引物的設(shè)計與合成27-30
• 2.3.2 舞毒蛾Ⅰ型幾丁質(zhì)酶催化區(qū)截短和催化區(qū)定點突變序列擴增30-33
• 2.3.3 重組表達載體構(gòu)建33-37
• 2.4 實驗結(jié)果37-42
• 2.4.1 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)截短載體構(gòu)建37-39
• 2.4.2 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)定點突變載體構(gòu)建39-42
• 2.5 討論42-44
• 第三章 舞毒蛾Ⅰ型幾丁質(zhì)酶催化區(qū)截短及突變在Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達及純化44-66
• 3.1 引言44-45
• 3.2 實驗材料45-48
• 3.2.1 實驗菌株及細胞45
• 3.2.2 實驗試劑45-46
• 3.2.3 相關(guān)溶液的配置46-48
• 3.2.4 實驗儀器48
• 3.3 實驗方法48-57
• 3.3.1 重組截短、突變型舞毒蛾幾丁質(zhì)酶基因真核表達載體的重組構(gòu)建48-51
• 3.3.2 細胞培養(yǎng)51-52
• 3.3.3 蛋白表達52-56
• 3.3.4 蛋白純化56-57
• 3.4 實驗結(jié)果57-64
• 3.4.1 四種舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)截短Bac to Bac系統(tǒng)蛋白表達57-61
• 3.4.2 六種舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)定點突變Bac to Bac系統(tǒng)蛋白表達61-64
• 3.5 討論64-66
• 第四章 舞毒蛾Ⅰ型幾丁質(zhì)酶催化區(qū)活性位點D143、D145的酶學(xué)活性研究66-78
• 4.1 引言66
• 4.2 實驗材料66-67
• 4.2.1 實驗試劑66-67
• 4.2.2 實驗儀器67
• 4.3 實驗方法67-69
• 4.3.1 蛋白標準濃度曲線的繪制67-68
• 4.3.2 蛋白樣品濃度測定68
• 4.3.3 幾丁質(zhì)酶活測定68
• 4.3.4 最適pH和最適溫度68-69
• 4.3.5 pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性69
• 4.4 實驗結(jié)果69-75
• 4.4.1 蛋白標準濃度曲線69-70
• 4.4.2 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)截短型和突變型幾丁質(zhì)酶活的分析70-71
• 4.4.3 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)突變型幾丁質(zhì)酶最適pH分析71-72
• 4.4.4 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)突變型幾丁質(zhì)酶最適溫度的分析72-73
• 4.4.5 pH穩(wěn)定性對舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)突變型酶相對活性的影響73-74
• 4.4.6 熱穩(wěn)定性對舞毒蛾幾丁質(zhì)酶催化區(qū)突變型酶相對活性的影響74-75
• 4.5 討論75-78
• 第五章 結(jié)論78-80
• 參考文獻80-84
• 致謝84-86
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及專利86

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：舞毒蛾Ⅰ型幾丁質(zhì)酶基因催化區(qū)截短和定點突變的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：365184