甜瓜是重要的園藝經(jīng)濟作物,是除了番茄以外的另一種可供選擇且非常重要的研究肉質(zhì)型果實發(fā)育的模式植物。本研究以甜瓜品種河套蜜瓜（Cucumis melo L.cv.Hetao melon）作為實驗材料,采用分子生物學(xué)的研究方法探究了在甜瓜果實發(fā)育過程中高表達的三個功能未知基因的特性及果實成熟過程中的作用。主要研究結(jié)果如下:⑴根據(jù)甜瓜果實的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到在甜瓜果實發(fā)育過程中高表達的三個功能未知基因:MELO3C015185,MELO3C020745和MELO3C011405。通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)MELO3C015185蛋白為疏水性蛋白,有一個跨膜結(jié)構(gòu)域、無信號肽,亞細胞定位預(yù)測該蛋白定位在細胞膜上。MELO3C020745蛋白和MELO3C011405蛋白均為疏水性蛋白,無跨膜結(jié)構(gòu)域、無信號肽。亞細胞定位預(yù)測MELO3C020745蛋白定位在細胞質(zhì)中,MELO3C011405蛋白定位在細胞核中。⑵實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,MELO3C015185基因表達量為莖>葉>雄花>生長期果實;MELO3C020745基因表達量在呼吸躍變期果實中最高,雄花中次之;MELO... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

乙烯生物合成途徑[11]

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文23圖2.1pCAMBIA1300(35S-Targetgene-sGFP)重組質(zhì)粒構(gòu)建流程Fig.2.1ConstructionofthepCAMBIA1300(35S-Targetgene-sGFP)recombinantplasmid2.2.5.4制備農(nóng)桿菌（GV3101）感受態(tài)⑴在10mLYEB液體培養(yǎng)基中加入200μL活化后的GV3101菌種，28℃恒溫搖床以180rpm的速度過夜振蕩培養(yǎng)。⑵次日，在50mLYEB（60μg/mL,Rif）液體培養(yǎng)基中加入5mL擴培菌液，28℃恒溫搖床，180rpm振蕩培養(yǎng)6-7h至OD600=0.5。⑶將50mL菌液放置冰水浴30min，再倒入50mL無菌離心管中，冷凍高速離心機中4℃、5000rpm離心5min，棄上清。⑷用10mLNaCl(0.15mol/L)溶液懸浮細胞，再次在冷凍高速離心機中4℃、5000rpm離心5min，棄上清。

甜瓜果實發(fā)育過程中高表達的三個未知功能基因的初步研究26圖2.2重組載體Ppzp221-Targetgene構(gòu)建策略圖Fig.2.2TheMapofconstructionofPpzp221-Targetgene2.2.6.3重組質(zhì)粒的PCR篩選長出的菌落參考2.2.4.3的PCR陽性檢測方法進行初步的篩選，得到陽性菌株的重組質(zhì)粒需要再次進行雙酶切驗證，進一步驗證目的基因是否插入到超表達載體中，且插入片段是否正確。將酶切驗證正確的菌株進行擴培，進行保菌放-80℃保存?zhèn)溆�。剩余菌液提取質(zhì)粒并檢測質(zhì)粒的濃度和純度，并將其命名為：pP-5185、pP-0745和pP-1405，放-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.7目的基因編輯載體的構(gòu)建2.2.7.1sgRNA靶位點的選擇及接頭引物的設(shè)計在CRISPR/Cas9技術(shù)中，Cas9蛋白通過與向?qū)NA(singleguideRNA,sgRNA)結(jié)合進行基因組編輯靶位點的切割，而Cas9蛋白需要與目的基因上的一段PAM序列結(jié)合，使Cas9蛋白與目的基因相連接[101]。在MELO3C015185、MELO3C020745和MELO3C011405基因序列的任一條鏈內(nèi)，選擇兩個具有5-(A/G)N19NGG常規(guī)靶位點或具有5-(T/C)N19NGG的非常規(guī)靶位點，按照CRISPR/Cas9系統(tǒng)接頭引物設(shè)計原則設(shè)計相應(yīng)的靶位點引物。根據(jù)要求，每個基因需要設(shè)計兩個編輯靶位點，靶位點位置及序列見圖2.3。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]低溫弱光對甜瓜幼苗生理特性的影響[D]. 李琦.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號：3525943